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Mar 22, 2023

磁性ヒドロゲル粒子が SARS のナノポア配列を改善する

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2163 (2023) この記事を引用

1407 アクセス

18 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ここでは、Oxford Nanopore Technologies MinION シーケンス プラットフォームを使用してシーケンス結果を大幅に向上させる、診断残存綿棒サンプルから SARS-CoV-2 を捕捉および濃縮するための磁性ハイドロゲル粒子を利用したワークフローを紹介します。 私たちのアプローチは、新しいアフィニティーベースの磁性ヒドロゲル粒子を利用し、サンプル投入量の少なさを回避し、ナノポアシーケンシングと互換性のある迅速な手動および自動の両方のハイスループットワークフローを可能にします。 このアプローチは標準的な RNA 抽出プロトコルを強化し、ウイルス マップされたリードを最大 40 倍向上させ、力価の低い診断残存サンプルからのシーケンシング カバレッジを 20 ～ 80% 向上させます。 さらに、このアプローチが人為的なインフルエンザ ウイルスおよび RS ウイルスのサンプルに対して機能することを実証し、VTM サンプル中の複数のウイルスの配列決定結果を特定および改善するために使用できることを示唆しています。 これらのメソッドは手動で実行することも、KingFisher 自動化プラットフォームで実行することもできます。

2022 年 4 月 10 日の時点で、世界中で 新型コロナウイルス感染症の感染者数は 5 億人を超え、新型コロナウイルス感染症に関連して 620 万人近くが死亡しています1。 SARS-CoV-2の蔓延を防ぐために世界規模で広範な保健対策が講じられているにもかかわらず、ウイルスの変異によりパンデミックが日常生活に浸透することが可能になった。 新たなウイルス変異体の検出とモニタリングは、世界的な健康対応において重要なツールとなっており、迅速に導入可能で正確なシーケンス手法の必要性が強調されています 2、3、4、5。 次世代シーケンス（NGS）技術の最近の進歩により、ウイルスの発生を監視および特定するためのシーケンスの日常的な使用がより可能になりましたが、多くの NGS 機器は持ち運びができず、依然として法外なコストがかかるため、全体の導入は制限されています 6,7。 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ (ONT) MinION プラットフォームは、比較的安価でポータブルな検出戦略を提供します。これは、現場でさまざまな呼吸器ウイルスを識別して配列決定できる 8、9、10 ものです。

配列決定の進歩により、SARS-CoV-2 やその他のウイルス ゲノムの迅速なオンサイト検出と特性評価が可能になりますが、これらのポータブル シーケンサーには依然として特定の欠点があります。つまり、配列決定反応に大量のウイルス RNA が使用されない限り、ベースコール中に精度の問題が発生する可能性があります11、12、13、14、15、16。 これらの技術的な制限により、ウイルスの発生に迅速かつ正確に対応し、リアルタイムで感染を追跡する能力を向上させるツールの有用性が低下します。

サンプル濃縮により分析用の RNA 材料の総量を増やすことは、シーケンシング プラットフォームのパフォーマンスを向上させるために利用できる戦略の 1 つです。 この目的を達成するために、我々は、アフィニティーベースの磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) 濃縮技術を SARS-CoV-2 ウイルス輸送媒体 (VTM) サンプルに適用することで、ナノポア シーケンサーのウイルス配列決定の限界に対処しようとしました。 簡単に言うと、磁性ヒドロゲル粒子は、大量のサンプルからの迅速な分析物（例えば、無傷ビリオン）の結合を促進し、下流のアッセイにおける干渉物質の存在を減らすことによって、アッセイ性能を向上させます。 ヒドロゲル粒子は、架橋ポリマー鎖のフレームワーク上に固定化されたアフィニティー色素などの小分子を使用して対象分析物を捕捉し、濃縮します。 これらの小分子は、静電相互作用と親水性相互作用の組み合わせを通じて、多くの場合非常に高い親和性で標的 (ビリオン表面タンパク質など) に結合します。 磁性ヒドロゲル粒子に結合すると、簡単な磁気分離ステップを使用してビリオンを濃縮し、サンプルマトリックスから除去できます。 濃縮後、ビリオンはヒドロゲル粒子アフィニティー色素にしっかりと結合しており、ウイルス核酸は分子分析に利用できません。 したがって、下流の分子アッセイに備えて、核酸抽出キットを使用してビリオンを溶解し、ウイルス核酸を精製します。 Nanotrap 粒子技術は、複雑な臨床サンプル中のバイオマーカーと分析物を濃縮および安定化することにより、臨床診断に幅広い用途を示しています。 最近の研究では、この濃縮および抽出プロセスが実証されており、磁性ヒドロゲル粒子が複数の分子アッセイで SARS-CoV-2 を含む多くのウイルスの種類を濃縮し、検出を向上させることができることが示されています 17、18、19、20、21。

ONT MinION シーケンサーなどのポータブル シーケンシング プラットフォームを利用する場合、入力 RNA の量を増やすと、より力価の低いウイルス サンプルのシーケンシングを成功させることができ、その結果、シーケンシングに使用できる患者サンプルの割合が増加する可能性があります。 理想的には、これにより特定のウイルス変異の同定が向上し、新たに出現する問題のある変異体への対応が促進されるはずです 22、23、24。

ここでは、磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) が現在のシーケンシング ワークフローを改善し、現在の標準的な RNA 抽出方法を強化することで新しいワークフローを実現できることを示します。 これらの磁性ハイドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) ワークフローにより、ウイルス マッピングされたリードの総数が増加し、シーケンスの深さとカバレッジが向上することでシーケンス結果が向上することを実証します。 ナノトラップ粒子ワークフローは、複数の RNA 抽出キット用に開発されており、その有用性は人工および診断用残存サンプルの両方で実証されています。

ナノトラップ磁気ウイルス粒子 (SKU: 44,202) は、バージニア州マナサスの Ceres Nanosciences Inc. によって提供されました。

人為的なサンプルは、VTM (Puritan UniTranz-RT Transport Systems、カタログ番号 89,233-458) にスパイクされた熱不活化ウイルスで構成されていました。 ウイルスストックから 106 TCID50/mL でスパイクしたニート VTM サンプルから開始して 5 つの濃度 (106、105、104、103、および 102 TCID50/mL) を生成し、4 つの 1:10 段階希釈を実行して濃度 102 まで下げました。希釈バッファーとしてニート VTM を使用した TCID50/mL。 開始ウイルスストック濃度は、製造業者が報告した濃度に基づいた。 熱不活化ウイルス: SARS-CoV-2 (カタログ番号 0810587CFHI)、インフルエンザ A-H1N1 (カタログ番号 0810109CFHI)、および呼吸器合胞体ウイルス A 型 (RSV) (カタログ番号 0810040ACFHI) は ZeptoMetrix から購入しました。

ウイルス輸送培地中の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプルは、アラバマ州ハンツビルの Discovery Life Sciences から購入しました。 Discovery Life Sciences は以前にこれらのサンプルを RT-PCR によってテストし、24 ～ 35 の範囲のサイクル閾値を得ました。Discovery Life Sciences から取得したサンプルは「生体試料購入契約」に従い、識別ガイドラインに準拠した次のデータ生成により匿名化されています。 qPCR やシーケンスなどの研究や出版にそのようなサンプルを使用できるようになります。

ナノトラップ粒子ワークフロー 1 (カラムベースの RNA 抽出キットを使用した手動磁性ヒドロゲル粒子法): 5 mg/mL の濃度の磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子) 200 マイクロリットルを 1000 μL の VTM サンプルに添加しました。 利用されたナノトラップ粒子の量は、以前のウイルス捕捉最適化実験 17、18、19、20、21 に基づいています。 サンプルを室温で 10 分間インキュベートし、次に磁気分離器上に 2 分間置き、Nanotrap 粒子をペレット化させました。 上清を除去して廃棄した。 100 マイクロリットルの RNAse/DNase フリー水と 350 μL の QIAGEN Buffer RLT を Nanotrap 粒子ペレットに添加しました。 サンプルを室温でシェーカー上で 10 分間インキュベートした後、磁気分離器上に 2 分間置いてナノトラップ粒子をペレット化させました。 ウイルス核酸物質を含む上清を、QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit (カタログ番号 74,204) を使用して、メーカーの 100 µL ワークフロー指示に従って RNA 抽出のために処理しました。 RNA 抽出後、RNA サンプルはシーケンシング ライブラリの準備の準備が整いました。

ナノトラップ粒子ワークフロー 2 (磁気ビーズベースの RNA 抽出キットを使用した手動磁気ヒドロゲル粒子法): 0.05% Tween-20 (v/v) を含む 300 マイクロリットルの PBS を 500 µL の VTM サンプルに直接添加しました。 200 マイクロリットルの磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) を各 VTM サンプルに添加し、室温で 10 分間インキュベートしました。 これらの実験に使用されたナノトラップ粒子の量は、以前に成功したウイルス捕捉ワークフローに基づいており、パフォーマンスとコストを考慮して最適化されました 17、18、19、20、21。 サンプルを磁気分離器上に 2 分間置き、Nanotrap 粒子をペレット化させました。 上清を除去して廃棄した。 ナノトラップ粒子ペレットを、0.05% Tween-20 (v/v) を含む分子グレードの水 1 mL に再懸濁しました。 簡単な再懸濁後、サンプルを再度磁気分離器上に 2 分間置き、Nanotrap 粒子をペレット化し、上清を除去して廃棄しました。 ナノトラップ粒子を 200 μL の MagMAX Microbiome Lysis Solution に再懸濁し、サンプルをシェーカー上で 65 °C で 10 分間インキュベートしました。 次いで、サンプルを磁気分離器上に置き、ナノトラップ粒子を２分間ペレット化させた。 ウイルス核酸物質を含む上清は、メーカーの 200 µL ワークフロー指示に従って、MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (カタログ番号 A42357) を使用して RNA 抽出を受けました。 抽出キットの処理後、RNA サンプルはシーケンシング ライブラリの準備の準備が整いました。

ナノトラップ粒子ワークフロー 3 (磁気ビーズベースの RNA 抽出キットを使用した自動磁気ヒドロゲル粒子メソッド): 次のメソッドでは、KingFisher 自動化プラットフォーム (KingFisher Apex) および関連する消耗品を使用しました。 0.05% Tween-20(v/v) を含む 300 マイクロリットルの PBS を、96 ディープウェル KingFisher プレート内の 500 μL VTM サンプルに直接添加しました。 200 マイクロリットルの磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) を各 VTM サンプルに添加しました。 これらの実験に使用されたナノトラップ粒子の量は、以前に成功したウイルス捕捉ワークフローに基づいており、パフォーマンスとコストを考慮して最適化されました 17、18、19、20、21。 0.05% Tween-20 (v/v) を含む分子グレードの水を 2 番目の 96 DW プレートに加え、200 μL の MagMAX Microbiome Lysis Solution を 3 番目の 96 DW プレートに加えました。 カスタム KingFisher プログラム「NT2MM.kfx」は、準備された 3 枚の 96 DW プレートを使用して Nanotrap 粒子を処理するために作成されました。 全プロセスは 30 分で完了し、最終溶出液には抽出されたウイルス RNA が含まれていました。

「Nanotrap Particle Workflow 2」と同様に、磁性ハイドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) 処理後、メーカーの 200 µL ワークフロー指示に従って、MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit を使用して、抽出されたウイルス RNA サンプルを処理しました。 このワークフローでは、抽出は KingFisher 自動化プラットフォームで自動化されました。 Nanotrap Particle Workflow 2 と 3 は、同じ試薬と抽出条件を使用し、機能的には同じであると著者らは考えていますが、唯一の明らかな違いは、「Nanotrap Particle Workflow 3」が KingFisher 自動化プラットフォームで実行されることです。 抽出キットの処理後、RNA サンプルはシーケンシング ライブラリの準備の準備が整いました。

上記の磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子) ワークフローは、ナノトラップ粒子を使用しない 2 つの標準抽出キット ワークフローに対してベンチマークされました。 ワークフロー 1 の比較では、メーカーの 100 µL ワークフロー指示に従って、QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit (カタログ番号 74,204) を使用してサンプルを処理しました。 ワークフロー 2 と 3 の比較では、メーカーの 200 µL ワークフロー指示に従って、ThermoFisher MagMAX マイクロバイオーム ウルトラ核酸分離キット (カタログ番号 A42357) を使用してサンプルを処理しました。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子) 法を使用すると、他の抽出法と比べてより多くのサンプル入力量を調べることができます。 ナノトラップ粒子ワークフロー 1 では、カラムメーカーの推奨入力量 100 μL に対して、当社のメソッドでは 1000 μL の VTM を処理するため、理論上の濃縮係数は 10 倍です。 臨床 VTM コレクションの容量に制限があるため、Nanotrap Workflow 1 μL に使用する容量を 1000 μL に制限したことに注意してください。

Nanotrap 粒子ワークフロー 2 および 3 では、シリカ ビーズ メーカーの推奨入力量 200 μL に対して、当社のメソッドでは 500 μL の VTM を処理するため、理論上の濃縮係数は 2.5 × です。 自動化を可能にするために、ワークフロー 2 と 3 に使用されるボリュームを制限し、KingFisher 自動化プラットフォームとの互換性を確保しました。

SARS-CoV-2 サンプルの RT-PCR 分析では、N1 プライマー/プローブを含む IDT 2019 nCoV CDC EUA キット (カタログ番号 1,006,770) をリアルタイム RT-PCR に使用しました。 IDT の推奨に従い、ThermoFisher (カタログ番号 A15300) の TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix が IDT 2019 nCoV CDC EUA アッセイに使用されました。 各 PCR 反応では、8.5 μL のヌクレアーゼフリー水、5 μL の TaqPath 溶液、1.5 μL の N1 プライマー/プローブ、および 5 μL の RNA テンプレートを使用しました。 PCR条件はIDTの指示に従ってRoche LightCycle 96で実施した。すべてのSARS-CoV-2（熱不活化および診断用残存物の両方）実験ではこのアッセイを利用した。

インフルエンザ A および RSV サンプルの RT-PCR 分析には、Primerdesign インフルエンザ A H1 キット (Path-H1N1-v2.0-Standard) および Primerdesign RSV キット (Path-RSV-A-Standard) をメーカーの指示に従って使用しました。 PCR条件は、Primerdesignの指示に従ってRoche LightCycle 96で実施した。

ウイルス RNA 抽出後、開発された ARTIC ネットワークを使用して配列決定用にサンプルが準備されました。 「nCoV-2019 シーケンスプロトコル v3（ローコスト）」25. 簡単に言うと、増幅された cDNA は、標的アンプリコン アプローチを使用して調製されました。 ARTIC nCov-2019 プロトコルに従って、IDT ARTIC V3 アンプリコン シーケンシング パネル プライマーを使用しました。 SARS-CoV-2 ゲノム全体をカバーするこれら 218 個のプライマーは、抽出されたウイルス RNA から cDNA を生成および増幅するために使用されました。 cDNAが調製されたら、Oxford Nanopore Technologies (ONT) Ligation Sequencing Kitを使用してサンプルを処理し、「nCov-2019 Sequencing Protocol v3」に従って修正された「One-pot」プロトコルを使用してONT Nativeバーコーディング拡張キットのネイティブバーコードを使用して個別にバーコード化しました。 (低コスト)」の説明書を参照してください。 これらの個々のサンプルを一緒にプールし、AMPure XP 磁気ビーズ (カタログ番号 A63880) を使用して濃縮しました。 プールされたライブラリは、ONT Mk1C シーケンス プラットフォームで使用される ONT FLO-MIN106 R.9 フロー セルにロードされました。 特に明記されていない限り、ONT Mk1C は、EXP-ND-196 バーコードが選択された LSK109 キットを使用して 24 時間実行されました。

ONT Mk1C プラットフォームによって生成されたシーケンス データを分析および処理するために、次のツールが使用されました。ONT Mk1C MinION デバイスに統合された ONT MinKnow ソフトウェアを使用して、ライブ ベースコールと逆多重化が実行されました。 一般的な分類とウイルス マップされたリードは、ONT の Epi2me Web ツールを通じて 2020 年 3 月 9 日の WIMP プロトコルを使用して生成されました。 さらに詳しいカバレッジ分析は、UseGalaxy.org Web ポータルを通じて Minimap2 と Samtools を使用して実施されました。 対応のある t 検定が実行され、Graphpad Prism 9 を使用して数値が生成されました。Nextclade とセンザンコウの分析は、EPI2ME Labs が開発した ARTIC SARS-CoV-2 Workflow26 を通じて実行されました。

これまでの研究では、磁性ハイドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) が、SARS-CoV-2、インフルエンザ A、インフルエンザ B、RSV17、18、19、20、21 を含む複数の呼吸器ウイルス病原体を捕捉し、濃縮することが実証されています。 この濃縮により、リアルタイム RT-PCR を含むさまざまな分子アッセイの結果が向上しました。 われわれは、Nanotrap 粒子がこれらの分子アッセイを改善できれば、配列決定に利用できるウイルス RNA の量を増やすことで配列決定プラットフォームも改善できるのではないかという仮説を立てました。 シーケンシングにおける Nanotrap 粒子テクノロジーの堅牢性と使いやすさを実証するために、3 つのワークフローが開発されました。カラムベースの RNA 抽出キットを使用した手動メソッド、磁気ビーズベースの RNA 抽出キットを使用した手動メソッド、および磁気ビーズベースの RNA 抽出キットを使用した自動化メソッド。

われわれは磁性ヒドロゲル（ナノトラップ粒子）を利用してSARS-CoV-2全ビリオンを捕捉・濃縮し、その後カラムベースのRNA抽出を行う方法を開発し、SARS-CoV-2のナノポア配列決定を改善するナノトラップ粒子の能力を検証した。 そのために、熱不活化 SARS-CoV-2 の人工 VTM サンプルを、QIAGEN RNeasy MinElute Cleanup Kit を使用した Nanotrap Particle Workflow 1 でウイルス RNA 抽出 ([+ NT]) を使用するか、Nanotrap 粒子を使用せずに Rneasy キットのみを使用して処理しました。 ([−NT])。 抽出された RNA サンプルは、ARTIC nCoV-2019 シーケンス プロトコルを使用してシーケンス用に準備され、方法セクションで説明したように ONT Mk1C シーケンサーで実行されました。 抽出されたウイルス RNA も IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR キットを使用して分析し、2 つのアッセイ間の潜在的な相関関係を特定し、SARS-Cov-2 の存在を確認しました。 図 1A に示すように、ナノトラップ粒子を使用しないワークフローと比較して、ナノトラップ粒子は複数の濃度でのシーケンス結果を改善しました。 SARS-CoV-2 ウイルス マッピング読み取りでは 106 TCID50/mL で 6.0 倍の改善が観察され、105 TCID50/mL では 2.0 倍の改善が見られました。 統計分析では、ウイルスの両方の濃度で p 値が < 0.05 であり、改善が顕著であることが示されました。 105 TCID50/mL 未満では、[+ NT] サンプルと [- NT] サンプルの間に有意な改善は見られませんでした。 RT-PCR を実行すると、Nanotrap 粒子は最初の 4 つの段階希釈全体でウイルス回収率を PCR サイクル閾値 (Cts) の 2 倍改善しました (図 1B)。 対応のある t 検定により、同じ 4 つの濃度で有意な改善が確認されました。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子ワークフロー 1) は、人為的な SARS-CoV-2 サンプルのシーケンスを改善します。 熱不活化 SARS-CoV-2 を 102、103、104、105、および 106 TCID50/mL で VTM にスパイクし、Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] または Rneasy キット単独 [- NT] を使用してサンプルを処理しました。 各プロセスの n = 3。 次に、サンプルを ONT MinION R.9 フローセル (a) または RT-PCR (b) でシーケンスしました。 ウイルス検出増加の有意性を評価するために、対応のある t 検定によって [+ NT] を [- NT] と比較しました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

カラム RNA 抽出は通常、サンプルスループットが低く、複雑性の高い実験室のベンチトップ環境で使用されます。 これらの制限を考慮して、我々は、磁気ビーズに基づく RNA 抽出方法を改善する磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) の能力を評価しました。 ナノトラップ粒子ワークフロー 2 は、ワークフロー 1 と同様の方法でテストされました。SARS-CoV-2 を含む人工 VTM サンプルは、ナノトラップ粒子を使用して ([+ NT]) またはナノトラップ粒子なしで ([- NT]) 処理されました。 [- NT] サンプルは、MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit のみを使用して処理されました。 RNA抽出後、ONT Mk1Cシーケンスプラットフォームで実行されるARTIC nCoV-2019シーケンスプロトコルを使用してシーケンス用にサンプルを調製しました。 処理された RNA サンプルは、IDT 2019 nCoV CDC EUA RT-PCR キットを使用した RT-PCR によっても分析され、ウイルスの存在が確認されました。

ナノトラップ粒子は、[- NT] ワークフローと比較して、複数の濃度でシーケンス結果を改善しました (図 2A)。 SARS-CoV-2 ウイルス マッピング読み取りでは 106 TCID50/mL で 1.9 倍の改善が観察され、105 TCID50/mL では 1.4 倍の改善が見られました。 統計分析により、両方の結果について計算された p 値 < 0.05 で有意性が確認されました。 さらに、ナノトラップ粒子はRT-PCRにおけるSARS-CoV-2の検出を改善し、102 TCID50/mLを超えるウイルス力価で平均1.5 Ctの改善をもたらしました（図2B）。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子ワークフロー 2) により、人為的な SARS-CoV-2 サンプルのシーケンスが向上します。 熱不活化 SARS-CoV-2 を 102、103、104、105、および 106 TCID50/mL で VTM にスパイクし、Nanotrap Particle Workflow 2 [+ NT] または MagMAX キット単独 [- NT] を使用してサンプルを処理しました。 各プロセスの n = 3。 次に、サンプルを ONT MinION R.9 フローセル (a) または RT-PCR (b) でシーケンスしました。 ウイルス検出増加の有意性を評価するために、対応のある t 検定によって [+ NT] を [- NT] と比較しました。 *p < 0.05、**p < 0.01。

人為的な VTM サンプルは、自然な環境でメソッドを評価するのに役立ちますが、メソッドが臨床サンプルでどのように機能するかを必ずしも示すわけではありません。 したがって、診断用残存臨床スワブ VTM サンプルを使用して、磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) のワークフローを評価しました。 我々は、RT-PCR 検査サイクル閾値が 24 ～ 35 の範囲であると報告されている (検体供給者による報告に従って) 10 個の診断用残存 VTM 検体を利用しました。 人為的に作成されたサンプルで確立されたのと同じ処理およびシーケンスのワークフローが、これらの診断残存サンプルにも使用されました。 シーケンス結果に対する Nanotrap 粒子ワークフローの影響をより適切に評価するために、ウイルス マップされたリードの合計と、処理サンプルの 30 × 深さでの関連するゲノム カバレッジ パーセントの両方を定量化しました。 Nanotrap 粒子ワークフロー 1[+ NT] を使用して生成された図 3A の結果は、Nanotrap 粒子が診断残存サンプル (n = 10) の 100% の配列決定結果を改善したことを示しています。 Nanotrap 粒子 [- NT] を使用しないワークフローと比較して、Nanotrap 粒子ワークフロー 1 を使用すると、すべての診断残存サンプルにわたってウイルス マップされたリードの合計が平均 7 倍向上しました。 これらのウイルスマップリードの改善により、ナノトラップ粒子を使用せずに処理したサンプルと比較して、ウイルスゲノムの平均カバー率が 52% 増加しました (図 3B)。 10 個のサンプルすべてにわたる対応のある t 検定は、ウイルス マップされたリードとカバレッジ パーセントの両方で増加が統計的に有意であることを示しています (図 3D、図 3E)。 図 3C では、RT-PCR により 10 サンプルすべてに SARS-CoV-2 の存在が確認され、[- NT] サンプルと比較して Ct が平均 4 向上しました。 Nanotrap 粒子を使用せずに処理した場合、3 つのサンプルは RT-PCR アッセイの検出限界を下回りましたが、Nanotrap 粒子をサンプル処理に使用した場合には 10 サンプルすべてに検出可能な RNA があったことは注目に値します。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子ワークフロー 1) により、診断用残存 SARS-CoV-2 サンプルのシーケンスが改善されます。 10 個の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプルを、Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] または RNEasy Kit 単独 [- NT] を使用して処理しました。 次に、サンプルは ONT MinION R.9 フローセルでシーケンスされ、SARS-CoV-2 へのウイルス マップ リード (a)、30 × 深さでのウイルス ゲノム カバレッジ (b)、または RT-PCR (c) によって分析されました。 ウイルス検出の増加の有意性を評価するために、対応のある t 検定によって [+ NT] を [- NT] と比較しました (d)、(e)。 ***p < 0.001。

磁性粒子ベースのサンプル処理の利点の 1 つは、この方法を容易に自動化できることです。 この目的を達成するために、KingFisher 自動化プラットフォームで使用される磁性ヒドロゲル粒子ワークフローの自動化バージョン (Nanotrap Particle Workflow 3) を開発しました。 このメソッドは機能的には Nanotrap Particle Workflow 2 と同じであり、同じ試薬と抽出ステップを利用し、同じパフォーマンス特性の恩恵を受けます。 私たちは、この自動化されたナノトラップ粒子ワークフロー 3 メソッド ([+ NT]) を、さらに 10 個の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプル ([- NT]) を使用したナノトラップ粒子を使用しないメソッドと比較し、シーケンシングと RT-PCR 出力を再度調べました。 2つの方法のうち。 Nanotrap 粒子処理により 10 サンプル中 7 サンプルのシークエンシング結果が大幅に改善され、ウイルス マップされたリードの総数が平均 42 倍向上したことが観察されました (図 4A)。 これは、[- NT] サンプルと比較してウイルスゲノム範囲の平均 51% 増加に相当しました (図 4B)。 対応のある t 検定により、Nanotrap 粒子がウイルス マップされたリード (図 4D) とゲノム カバレッジ (図 4E) の両方を大幅に改善することが確認されました。 以前の診断用残存サンプルのセットと同様に、RT-PCR により 10 サンプルすべてに SARS-CoV-2 の存在が確認されました。 [+ NT] 自動プロセスにより RT-PCR 結果も改善され、図 4C に示すように平均 3.7 Ct の改善が得られました。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子ワークフロー 3) は、診断用残存 SARS-CoV-2 サンプルのシーケンスを改善します。 10 個の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプルを、Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] または MagMAX キット単独 [- NT] を使用して処理しました。 次に、サンプルは ONT MinION R.9 フローセルでシーケンスされ、SARS-CoV-2 へのウイルス マップ リード (a)、30 × 深さでのウイルス ゲノム カバレッジ (b)、または RT-PCR (c) によって分析されました。 ウイルス検出の増加の有意性を評価するために、対応のある t 検定によって [+ NT] を [- NT] と比較しました (d)、(e)。 *p < 0.05、**p < 0.01。

Nanotrap Particle Workflow 3 を使用して 10 個の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプルを処理して配列決定した後、ウイルス マッピング リードとゲノム カバレッジ パーセントの向上が下流の SARS-CoV-2 分析にどのような影響を与えるかをさらに評価しました。 具体的には、EPI2ME labsのバイオインフォマティクスツール「ARTIC SARS-CoV-2 Workflow」を使用してパンゴリン分析とNextclade分析を実行し、磁性ヒドロゲル粒子（ナノトラップ粒子）濃縮によって得られる潜在的な改善の特徴をさらに明らかにしました。 これらは、SARS-CoV-2 変異体を追跡および分析するために広く使用されている SARS-CoV-2 バイオインフォマティクス系統ツールであり、配列データの特徴付けと比較のための容易に理解できる定性的指標を生成します。 簡単に要約すると、Pangolin は SARS-CoV-2 系統割り当てパイプラインであり、入力配列を元の野生型武漢配列にアライメントすることから始まります。 次に、このツールは、整列されたコード領域で検出された変更を既知のバリアントのデータベースと比較し、最も近い既知のバリアントを出力する系統レポートを生成します。 最後に、系統レポートが正しい可能性を示す「曖昧さスコア」が生成されます。 0 ～ 1 の範囲で、スコアが低いほど「あいまいさ」が低くなり、分析が正しいという信頼レベルが高くなります。 Pangolin と同様に、Nextclade は多層アライメント ツールであり、入力配列と武漢配列を比較して、以前に検出された変異体に最もよく一致する変異を特定します。その結果、系統レポート、変異数、ゲノム範囲を示すアラインメント マップ、および一般的な結果が得られます。分析されるデータの QC メトリック。 Pangolin を利用して、[+ NT] と [- NT] の両方の処理サンプルの系統レポートと曖昧さスコアを生成しました。 [- NT] サンプルの場合、Pangolin は 10 サンプル中 3 サンプルについてのみ系統レポートを生成でき、平均曖昧性スコアは 0.824 でした。 しかし、ナノトラップ粒子 [+ NT] の存在下では、パンゴリンは 10 個のサンプルすべてを特徴付けることができ、平均曖昧さスコア 0.898 を生成しました。これは、ナノトラップ粒子がサンプルを特徴付けるソフトウェアの能力を向上させることができたことを示しています (図 5A)。

磁性ヒドロゲル粒子（ナノトラップ粒子）は、SARS-CoV-2 サンプルを分析する際のバイオインフォマティクス ツールを改善します。 10 個の SARS-CoV-2 陽性診断残存サンプルを、Nanotrap Particle Workflow 3 [+ NT] または MagMAX キット単独 [- NT] を使用して処理しました。 サンプルは ONT MinION R.9 フローセルでシーケンスされ、Pangolin (a) と Nextclade によって分析され、次の評価が行われました: 10 サンプルすべての QC スコアの比較 (b)、サンプルごとに全ゲノム位置を特徴付けることができない (n が欠落している) 、少ない = 良い) (c)、サンプルごとに検出された変異の合計 (d)。

Nextclade 分析では、Nanotrap 粒子の使用でも同様の傾向が明らかになり、より多くのサンプルをより高い品質評価で特性評価できるようになりました。 Nextcladeでは「良い」「普通」「悪い」の3段階のQCシステムを採用しています。 QC 層は、ウイルス ゲノムを正確に評価し、正確な分類を決定するために Nextclade によって提供されたデータのどの程度を特徴付けることができたかを示します。 サンプルが提供するデータが分類に割り当てるのに不十分な場合、サンプルは「評価なし」となります。 ここでは、ナノトラップ粒子で処理されたサンプル 10 個中 10 個の特性が評価され、10 個中 6 個のサンプルが QC 評価「良好」、10 個中 4 個の QC 評価が「不良」でした。 [- NT] サンプルでは、​​10 サンプル中 2 サンプルが「平凡」の QC 評価を受け、10 サンプル中 6 サンプルが「不良」の QC 評価を受けました。 残りの 2 つのサンプルは特性評価できず、評価も受けられませんでした。これは、Nanotrap 粒子によってソフトウェアのサンプル特性評価能力が向上し、以前は「不良」または「平凡」だったサンプルが「良好」なサンプルになることが可能になったことを示しています (図 5B)。 さらに、Nanotrap粒子処理により、欠落塩基の量が平均15,556「n」、つまりNextcladeで特徴づけることができないウイルスゲノム位置の数が減少することにより、Nextclade分析が改善されました（図5C）。 「欠落したn」はウイルスゲノムの盲点であり、その位置に変異が存在するかどうかを判断するために使用することはできません。これらの「欠落したn」もNextcladeの品質評価に寄与します。 「欠落n」が少ないほど、Nextcladeツールはより正確で有用になり、SARS-CoV-2ゲノムの大部分の分析が可能になります。 ナノトラップ粒子で処理したサンプルの場合、Nextclade は、ナノトラップ粒子なしで処理したサンプルと比較して、サンプルあたり平均 9.2 個多くの変異を検出しました (図 5D)。 全体として、これらの結果は、Nanotrap 粒子のウイルス濃縮により、一般的なバイオインフォマティクス ツールを使用したサンプルのより適切な分析が可能になることをさらに示しています。

理想的には、ウイルス濃縮技術は、SARS-CoV-2 だけでなく、複数のウイルスの濃縮を可能にする必要があります。 これまでの研究で実証されているように、磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) はさまざまな呼吸器ウイルスを捕捉します。 私たちは、ナノトラップ粒子がインフルエンザ A (H1N1) および呼吸器合胞体ウイルス (RSV) の配列決定を改善するためにも使用できるかどうかを簡単に調査しました 18、19、20。 ニート VTM に、不活化インフルエンザ A または RSV を 106 TCID50/mL で個別にスパイクしました。 以前に確立されたカラムベースの RNA 抽出プロトコルを使用して、ウイルスの人工サンプルを Nanotrap Particle Workflow 1[+ NT] で処理し、結果を Nanotrap 粒子を使用せずに処理したサンプル [- NT] と比較しました。 次に、得られた RNA 溶出液を、インフルエンザ A および RSV に特異的なプライマーを使用する ARTIC Library Prep プロトコールの修正バージョンを使用して配列決定用に調製しました。 サンプルは ONT Mk1C で実行されました。 図６Ａおよび図６Ｃの結果は、ナノトラップ粒子が、それぞれ人工インフルエンザＡおよびＲＳＶサンプルについてのナノポア配列決定結果を改善することを実証している。 ナノトラップ粒子は、ナノトラップ粒子を使用せずに処理したサンプルと比較して、インフルエンザ A と RSV の両方でウイルス マッピングされたリードを 4 倍改善しました。 さらに、サンプル処理におけるナノトラップ粒子の使用により、RT-PCRによって測定されるインフルエンザA型およびRSVそれぞれのウイルスRNAの検出が向上した(図6B、図6D)。 対応のある t 検定により、Nanotrap 粒子による改善が統計的に有意であり、計算された p 値 < 0.05 であることが確認されました。 これらの結果は、Nanotrap 粒子を使用して VTM サンプル中の複数のウイルスの配列結果を特定し、改善できることを示しています。

磁性ヒドロゲル粒子 (ナノトラップ粒子) は、複数の呼吸器ウイルスの配列決定を改善します。 熱不活化インフルエンザ A (H1N1) (a、b) または RSV (c、d) を 106 TCID50/mL で VTM にスパイクし、Nanotrap Particle Workflow 1 [+ NT] または Qiagen RNEasy Kit 単独を使用してサンプルを処理しました [- NT]; 両方のプロセスで n = 3。 次に、サンプルを ONT MinION R.9 フローセルまたは RT-PCR でシーケンスしました。 ウイルス検出増加の有意性を評価するために、対応のある t 検定によって [+ NT] を [- NT] と比較しました。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

次世代シーケンスおよび後処理増幅技術の最近の進歩により、シーケンス実行の成功と正確な変異検出に必要なウイルス力価が減少しました 27,28。 これらの進歩により、シーケンスアプリケーションの感度は一般的に向上しましたが、特定のシーケンスプラットフォームでは、ウイルス力価が低いためにシーケンスできない臨床的に関連のあるウイルスサンプルのかなりの部分が依然として存在しており、サンプルにはバイオインフォマティクスツールが使用できる核酸分子が不十分です。生物学的変異とエラーを確実に区別しながら、参照ゲノム全体をカバーします。 より具体的には、配列決定プラットフォームは、処理された RNA サンプルからシーケンサーによって生成された生シグナルからヌクレオチド フラグメントの読み出しを「ベースコール」または作成します。 これらの塩基と呼ばれるフラグメントはデータベースと比較およびマッピングされ、フラグメントのゲノム分類が特定されます。 このマッピングプロセス中に、分析されたサンプルと参照ゲノムの間で差異が伝播します。 読み取り値のこれらの違いは、実際の遺伝子変異または誤った塩基呼び出しのいずれかに起因する可能性があり、後者はシーケンサー自体または不十分な核酸材料によって引き起こされる可能性があります。 塩基と呼ばれるフラグメントの数を増やすと、読み取り深度が大きくなり、この問題のある重複が明確になり、検出されたバリエーションが生物学的であり、アーチファクトではないという確信が高まります 11、12、13、14、15。

Oxford Nanopore MinION シーケンス プラットフォームは、コンパクトで複雑性の低い第 3 世代シーケンス テクノロジーであり、通常シーケンスに関連する初期費用を大幅に削減します。 この技術には多くの魅力的な利点がありますが、感度と精度の制限により、使用可能な臨床サンプルプールはより高い力価のサンプルに制限されています29、30、31。 私たちはこの制限を、配列決定される核酸物質の量を増やし、利用可能な臨床サンプルのプールを増やすための潜在的な濃縮戦略を検討する機会とみなしました。 この目的を達成するために、我々は、磁性ヒドロゲル粒子ベースの (Nanotrap 粒子) フロントエンド ウイルス捕捉および濃縮方法を、人工 VTM サンプルと診断​​用残存サンプルの両方に適用しました。

磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) は、人工サンプルから SARS-CoV-2 を捕捉して濃縮することで配列決定結果を大幅に改善し、2 つの標準的な RNA 抽出法の出力を向上させました。 さらに、ナノトラップ粒子がONT Mk1Cシーケンスプラットフォームのウイルスマップリードを大幅に増加させることが示されるSARS-CoV-2の一般的な使用濃度範囲を特定しました。 Nanotrap 粒子ワークフロー 1 と 2 の両方で、シーケンシングと RT-PCR の改善が見られました。Nanotrap 粒子の前処理を行わない RNA 抽出キットによってもたらされた結果と比較して、両方のワークフローは、複数の時点で SARS-Cov-2 のウイルス マップされた総リード数を大幅に改善しました。濃度。 2 つのワークフローのうち、カラムベースの Nanotrap Particle Workflow 1 では、コンパレータに比べて大きな改善が見られました。 このワークフローでは、より大きなサンプル量が使用され、コンパレーターと比較してより大幅な量の濃縮が可能になりました。

磁気ビーズベースの RNA 抽出キットのアプローチでは、カラムベースの RNA 抽出と比較して、ナノトラップ粒子を使用または使用せずに処理したサンプルのすべての濃度にわたって、ウイルスマッピングされたリードが一般に高かった。 これは、磁気ビーズ抽出キットの RNA 抽出効率が高く、より高い割合の RNA を結合および溶出していることを示唆しています。 RT-PCR の結果はこの理論を裏付けました。 私たちは、磁気ビーズアプローチにより、カラムベースのアプローチよりも10倍低い濃度でSARS-CoV-2を検出できることを観察しました。 ウイルスマッピングされたリード数は、ナノトラップ粒子ワークフロー 1 と比較してナノトラップ粒子ワークフロー 2 の方が高かったが、ナノトラップ粒子がリード数を大幅に向上させる濃度範囲は両方のワークフローで同様であり、より高濃度のサンプルのシーケンス結果が向上しました。 通常、これらの高濃度は、事前濃縮を行わない従来のシーケンスではそれほど問題になりませんが、高力価サンプルを改善すると、シーケンスの深度に迅速に到達できるため、これらのサンプルタイプのシーケンスと分析を成功させるために必要な時間が短縮されるため、依然として有用です。 RT-PCR の結果は、ナノトラップ粒子の濃縮が両方のワークフローの低濃度サンプルに対して有効であることを示し、全体的な感度がより高い代替シーケンス プラットフォームでは、ナノトラップ粒子がこれらの低力価ウイルス サンプルのシーケンスも改善できることを示唆しています。

さらに、ナノトラップ粒子のワークフローは、ナノトラップ粒子を使用しないワークフローと比較して、臨床関連の診断残存サンプルのシーケンスおよび RT-PCR 結果を改善することが結果から示されています。 Nanotrap 粒子は、人為的に作成された VTM サンプルよりも、残存診断サンプルの配列決定結果を大幅に向上させるようです。 この研究で処理されたサンプルは、臨床的に関連するコホートを代表するように選択され、Ct 値は 24 ～ 35 の範囲でした。 Ct 値と Nanotrap 粒子濃縮ユーティリティの間に密接な相関関係があるようには見えませんでした。 興味深いことに、ほとんどの診断残存サンプルは、ウイルス濃度に関係なく、Nanotrap 粒子濃縮の恩恵を受けました。 この強化は、サンプル投入量の違いから生じる理論上の濃縮を考慮すると、さらに説得力があります。 ワークフロー 1 および 3 では、ナノトラップ粒子を使用せずに処理したサンプルと比較して 10 倍または 2.5 倍の改善が期待されました。 しかし、診断残存サンプルのウイルスマップリードで 40 倍以上の濃縮が観察されたため、これははるかに上回りました。 私たちは、人間から収集された VTM には通常、より多くの生物学的残骸が含まれていると仮定します。その結果、ナノトラップ粒子を使用しないワークフローは阻害の影響を受ける可能性が高くなりますが、ナノトラップ粒子の前処理は追加のサンプルのクリーンアップを通じてこの有害な物質を削減します。 Nanotrap 粒子の構造により、宿主細胞の破片やその他の汚染物質を削減しながら、目的のウイルス物質の捕捉が可能になる可能性があります。 ここで評価したシーケンシング ライブラリー調製ワークフローは、ヒトの細胞物質によって悪影響を受ける可能性があるポリメラーゼベースの増幅ステップに依存していました。 ウイルス物質を捕捉および濃縮しながらバックグラウンド物質をクリーンアップすると、Nanotrap ワークフローによってこの増幅ステップがさらに改善され、診断用残存 VTM サンプルの合計ウイルス マッピング リードがさらに多く生成されます。 さらに、この濃縮は、Ct 値が低いサンプル、つまりシーケンスに「有用な」サンプルを規定する qPCR 基準を通常満たしているサンプルでも観察されましたが、実際には有用なシーケンス結果を生成するのにまだ苦労しています。 これは、磁性ハイドロゲルのワークフローが、力価の低いサンプルだけでなく、シーケンスに失敗した高濃度の臨床サンプルにも役立つ可能性があることを示している可能性があります。

ナノトラップ粒子は、両方のワークフローにおいて、大部分の診断残存サンプルのウイルス マッピングされた読み取りを大幅に改善しました。 その結果、ウイルスゲノムのカバー率も診断残存サンプルの大部分で増加し、特定の診断残存サンプルでは 80% 増加しました。 これらのデータは、ナノトラップ粒子が配列決定に使用できるサンプルの割合を大幅に増加させる可能性があることを示唆していますが、これを確認するにはより大きなサンプルセットを実行する必要があります。 Nanotrap 粒子を使用した場合に統計的に有意な改善が見られなかったサンプルの一部は、Nanotrap 粒子を使用せずに処理した場合にはすでに比較的完全なゲノムをカバーしていたことは注目に値します。

Nanotrap 粒子を使用したときに見られる改善の実用性をさらに評価するために、SARS-CoV-2 変異体の追跡と分析に世界的に一般的に使用されている 2 つのバイオインフォマティクス ツールである Pangolin と Nextclade を使用して配列データも分析しました 32,33,34。 これらのツールは、変異を検出および分類する能力、変異分析を成功させるためのデータ要件、および情報の品質を決定するそれぞれの定性的指標に基づいて選択されました。 これにより、Nanotrap 粒子濃縮がシーケンシング データにどの程度影響を与えるかをより適切に判断するために使用するグレーディング システムが提供されました。 私たちは、テストされた診断残存サンプルの大部分について、Nanotrap 粒子プロセスにより、これらのバイオインフォマティクス ツールがより効果的に機能するようになり、特定の低力価サンプルについては、Pangolin と Nextclade の両方が、他の方法では失敗したであろう分析を成功裏に完了できることを観察しました。データが不足しているため。 Nextclade は、Nanotrap サンプルの SARS-CoV-2 ゲノム全体をより適切にマッピングすることもでき、[- NT] コントロールと比較してサンプルあたりより多くの総変異を特定しました。 これは、ナノトラップ粒子を使用すると、研究者がナノトラップ粒子プロセスによって提供される感度の向上なしでは検出されない変異体をより効果的に追跡および検出できる可能性があることを示唆しています。

公衆衛生の現場でシーケンスをさらに有効にするには、サンプルのスループットとワークフローの考慮事項に対処する必要があります。 KingFisher 自動化プラットフォームなどの自動化システムは、容易に拡張可能であり、すでに臨床検査室の処理ツールとして使用されています 35。 Nanotrap 粒子は、Nanotrap Workflow 3 を使用して処理した場合、10 個の陽性診断残存サンプルの配列結果を改善し、ハイスループット自動システムでの有用性を実証しました。 この自動化メソッドにより 1 時間で 96 個のサンプルの処理が可能になることは注目に値します。これは手動カラム抽出メソッドよりも大幅に高速ではるかに使いやすく、中から高スループットのラボにとって魅力的な提案になります。

SARS-CoV-2 に加えて、Nanotrap 粒子は呼吸器病原体を含む幅広いウイルスの捕捉に使用できることが実証されています 17、18、19、20、21。 ただし、現在まで、Nanotrap 粒子ワークフローを使用した場合のウイルス配列データは公開されていません。 ここで、我々は、ナノトラップ粒子が、2つの一般的な呼吸器ウイルスであるインフルエンザA型およびRSVも捕捉および濃縮できることを示す以前の報告を確認した。 さらに、Nanotrap 粒子ワークフローが複数の呼吸器病原体の配列決定と互換性があり、両方のウイルスのウイルス マッピング リードが増加することを実証しました。 これは、Nanotrap 粒子ワークフローをシーケンスによる大規模なウイルス検出の改善に使用できることを示唆しています。

この研究には、評価されたサンプルの数をはじめ、特定の制限が含まれています。 VTM サンプルのシーケンス時に Nanotrap 粒子プロセスによってもたらされるプラスの改善を確認するために、十分な数の反復がテストされましたが、ワークフローが提供できる倍数濃縮をより適切かつ正確に定量化するには、より多くのサンプルを実行する必要があります。 また、さまざまな SARS-CoV-2 変異体の配列決定を改善するナノトラップ粒子の能力を直接評価しませんでした。 しかし、ナノトラップ粒子の一般的なウイルス捕捉の性質を考慮すると、野生型 SARS-CoV-2 で見られる配列決定の改善は、他のほとんどの SARS-CoV-2 変異種の改善に対応すると予想されます。 今後の実験では、検出の増加に基づいて既知の変異体を含むサンプルのナノトラップ粒子濃縮を評価することで、この仮説を検証する可能性があります。 また、ナノトラップ粒子ワークフローが一度に配列決定に使用できる臨床サンプルの数を増やすことができるかどうかを調べるために、低力価の既知の変異を含む診断残存サンプルのテストプールを作成することもできます。 さらに、人為的に作成されたインフルエンザ A 型および RSV サンプルのみが検査されたため、現時点では、ナノトラップ粒子プロセスが生物学的により複雑な培地中でこれらの呼吸器病原体の配列を決定できると明確に断言することはできません。 また、複数のウイルスに同時感染したサンプルで何が起こるかについても調査しませんでした。 これにより、ウイルスのナノトラップ粒子に対する親和性が他のウイルスよりも高い場合、ナノトラップ粒子が特定のウイルスに偏る可能性があります。 今後の実験では、インフルエンザA型またはRSVを含むより臨床的に関連性の高い診断残存サンプルを使用するとともに、共感染サンプル中でナノトラップ粒子がどのように挙動するかを調べる必要がある。 また、口腔液（侵襲性の低いウイルス呼吸器検査に使用できる）や廃水（地域社会でのウイルス呼吸器病原体の監視に使用できる）など、代替サンプルタイプへのこのアプローチの追加応用を検討する余地もあります。 今後、私たちはこれらの各分野に取り組み、この汎用性の高い濃縮技術を使用したウイルス監視アプリケーションの検討を継続できるようにする予定です。

全体として、この研究は、磁性ハイドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) 濃縮により、ONT MinION Sequencer を使用した VTM での困難な臨床サンプル、つまりシーケンスには適していなかった可能性のあるサンプルのシーケンスが可能になることを示しています。 私たちのメソッドは濾過や遠心分離のステップを必要としないため、このアプローチは KingFisher 自動化プラットフォームを含む中および高スループット環境と互換性があります。 さらに、磁性ヒドロゲル粒子 (Nanotrap 粒子) 濃縮法と ONT シーケンス プラットフォームを組み合わせることで、よりアクセスしやすいシーケンスの取り組みが可能になります。 両方の技術の比較的低コストと可搬性を考慮すると、この組み合わせシステムは、研究室のリソースが限られており、従来のシーケンス装置へのアクセスが制限されている領域に展開できる可能性があります。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、Github リポジトリ https://github.com/Ceres90/NT-Extraction-Data で入手できます。 参照ゲノム: 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 分離株武漢-Hu-1、完全なゲノム受入番号: NC_045512。

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この出版物は、米国疾病管理予防センターからの SBIR 助成金 1 R43IP001142-01 と、国立生物医学画像生物工学研究所からの連邦資金の全部または一部により資金提供された NIH 診断の急速加速 (RADxSM) イニシアチブによって支援されました。 、国立衛生研究所、保健福祉省、契約番号 75N92020C00021 に基づく。 その内容は著者のみの責任であり、必ずしも疾病管理予防センターまたは国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

P.アンダーセン

現在の住所: Ceres Nanosciences, Inc.、マナサス、バージニア州、20110、米国

Ceres Nanosciences, Inc.、マナサス、バージニア州、20110、米国

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PA、NS、DG、JF、KB が実験を実施し、ウイルスの捕捉、ウイルスの抽出、ウイルスの検出に貢献しました。 AP、DM、SM、SS、RK、CR、SM、DW、JS、FN、OS、AM、KK、および KH は、Nanotrap® 粒子の生産と品質管理に貢献しました。 PA、RB、TJ、BL、SB、RD、RAB がデータの表示とフォーマットに貢献しました。 PA、SB、RAB、および BL はデータを分析および解釈し、実験計画に関与しました。 PA、RB、TJ、BL、SB、RD、および RAB は、この研究の全体的な方向性と調整も提供しながら、原稿の執筆と編集に関与しました。 著者全員がその原稿を承認した。

P.アンダーセンまたはB.レペネとの通信。

PA、SB、RAB、NS、JF、KB、DG、RB、RD、TJR、RK、SM、CR、AM、SM、LS、DM、SS、OS、KH、DW、KK、FN、JS、AP、 BL は Ceres Nanosciences Inc. の従業員です。

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転載と許可

Andersen、P.、Barksdale、S.、Barclay、R. 他。 磁性ヒドロゲル粒子は、SARS-CoV-2 およびその他の呼吸器ウイルスのナノポア配列決定を改善します。 Sci Rep 13、2163 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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受信日: 2022 年 4 月 18 日

受理日: 2023 年 1 月 31 日

公開日: 2023 年 2 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29206-7

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