細胞量測定を使用した、悪性腫瘍および治療法に依存しない抗がん剤反応評価のためのパイプライン

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1295 (2022) この記事を引用

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機能的精密医療は、患者の腫瘍細胞に対する薬効を直接テストすることにより、ゲノミクスに基づくがん治療ガイダンスを補完する有望な手段を提供します。ここでは、インライン明視野イメージングと機械学習ベースの画像分類による単一細胞質量測定を利用して、がん機能検査の臨床的有用性を広げるワークフローについて説明します。これらの画像で精選された質量測定値を使用して、12 種類の異なる細胞にわたるさまざまな作用機序を持つ 60 種類の薬剤の質量応答シグナルを特徴付け、標準的な細胞生存率アッセイと比較して、いくつかの遅効性薬剤に対する応答検出能力が向上していることを実証しました。さらに、当社はこのワークフローを使用して、血液、骨髄、細針吸引物（FNA）、悪性体液などのさまざまな原発腫瘍検体フォーマットの薬物反応を評価します。すべて 2 日以内にレポートが作成され、患者の臨床反応と一致する結果が得られます。このワークフローによって提供される高解像度測定、広範な薬物および悪性腫瘍への適用性、および結果の迅速な返還の組み合わせは、このワークフローが癌薬物反応の臨床的に関連する機能評価を実行するのに非常に適していることを示唆しています。

高精度腫瘍学に有効なバイオマーカーには、治療に対する患者の反応を予測することに加えて、日常的な臨床がん治療の制約内でデータ収集に適した測定アプローチが必要です。主な制約には、特性評価のための腫瘍検体の量が限られていること、生物学的不均一性、臨床での実用性を確保するための結果の迅速な返却の要件などが含まれます。

ゲノムバイオマーカーは精密腫瘍学における治療選択の指針となるゴールドスタンダードとなっており、明確に定義されたいくつかのゲノム変化に対して顕著な臨床上の利点を実証しています1、2、3。しかし、最近の臨床結果は、そのようなゲノミクス主導のアプローチの範囲が依然として限られていることを示しています。最も注目に値するのは、国立がん研究所 - 治療選択のための分子分析 (NCI-MATCH) 研究で、実用的な変異の特定に基づいて治療法が割り当てられた患者は 20% 未満であることが判明したことです4。患者の転帰も考慮すると、最近の研究では、患者の約 5 ～ 7% がゲノム標的療法による臨床的利益を示していることが判明しています 5,6。さらに、最初は治療に反応した患者が耐性を発現することが多く、その時点でその後の実用的な変異の分析でさらなる治療の指針となる追加情報が得られることはほとんどありません7。したがって、より広範ながん患者集団に対する合理的な治療法選択を可能にするために、ゲノムアプローチを補完する新しいツールが非常に必要とされています。

機能的精密医療は、そのようなアプローチの 1 つを提供します 8,9。抗がん剤反応を予測するための分子、組織学的、ゲノムバイオマーカーは細胞機能の代理測定に依存して薬剤選択に情報を提供する可能性がありますが、機能的精密医療では代わりに、患者の腫瘍から単離された生細胞に対する特定の薬剤の効果を直接測定します。このアプローチには、潜在的な薬効について真に個別化されたバイオマーカーを提供できるという利点があります。しかし、生細胞の必要性は、臨床的に最も利用しやすい検体フォーマットによってもたらされる細胞性の制限、細胞生存率の損失、生体外での急速な表現型変動など、検査に明確な課題をもたらします。これらの制約のため、機能的精密医療における最近の多くの開発努力は、新鮮な腫瘍標本からの豊富な生細胞へのアクセスがより日常的に実現可能な血液悪性腫瘍に焦点を当てている10、11、12、13、14、15。しかし、固形腫瘍に対するこれらのアプローチの広範な適用は依然として困難であり、薬物反応試験を可能にするために生体外で細胞を増殖させるための長期培養が必要となることが多い16、17、18。新たに単離された固形腫瘍細胞で薬剤をより迅速に検査するという最近の進歩は奨励されているにもかかわらず 19、これらのバイオマーカーは、ルーチンの臨床検査を可能にするワークフローにはまだ変換されていません。

抗がん剤反応の広く適用可能な機能検査の主な要件は次のとおりです。 (1) 柔軟性: 検査は、標準的な臨床治療の一環として収集されるさまざまな腫瘍標本の形式に適合する必要があり、バイオマーカーはがんの薬剤に対する反応を検出する能力を実証する必要があります。異なるクラス。 (2) 感度と堅牢性: アッセイは、非常に異質な標本からの細胞集団の微妙な変化を識別できなければなりません。 (3) 速度: 細胞生存率の損失と ex vivo での急速な表現型の変動により、反応評価の前に長期的な薬物投与戦略が妨げられることがよくあります。さらに、特に進行性または進行性疾患の患者の治療上の意思決定を効果的に導くためには、臨床的に実行可能な期間内にアッセイ結果を返さなければなりません。

単一細胞質量測定は、機能的精密医療アッセイのトランスレーショナル要件を満たすのに独特に適しています。表現型の統合的な生物物理学的読み取りとして、細胞質量は有効な薬剤による治療に反応して急速に変化することが示されており、単一細胞測定として、比較的少数の細胞を使用して集団を特徴付けることができます20、21、22、23。、24。さらに、細胞質量変化のこれらの測定値は、さまざまな悪性腫瘍における患者の治療反応と相関することが示されています 23,24。しかし、他の機能測定アプローチと同様に、これらの生細胞測定を実行する際のロジスティック上および技術的な課題により、その臨床応用性は引き続き制限されています。

ここでは、血液悪性腫瘍と固形腫瘍の両方の悪性腫瘍のさまざまな一次検体フォーマットで薬効を評価するためにこのアプローチを使用する実現可能性を実証することにより、単一細胞質量ベースの薬物反応検査の潜在的な適用範囲を拡大するエンドツーエンドのワークフローについて説明します。 (図1)。さまざまな標本形式に特有の輸送および腫瘍細胞単離プロトコルを使用して、生存可能な単一細胞懸濁液が生成されます（方法）。インビトロでの一晩の薬物処理の後、これらの細胞集団の質量分布は、懸濁されたマイクロチャネル共振器 (SMR) を組み込んだマイクロ流体プラットフォームを使用して測定されます。 SMR センサーは、他の場所で詳しく説明されているように、単純なフロースルーチャネル構成で細胞質量の高精度の測定を可能にします 25、26、27。質量測定に加えて、質量センサーを通過する各粒子の明視野画像が収集され、その後、畳み込みニューラルネットワーク (CNN) ベースの画像分類器を使用して注釈が付けられ、下流の統計解析に目的の単一細胞のみが使用されることが保証されます。この完全なワークフローは、堅牢な技術的再現性を示しており (補足図 1)、通常は 2 日以内に完了します。

サンプルの収集と出荷、b 腫瘍細胞の分離と一晩の薬物インキュベーション、c 明視野イメージングとリンクされた 12 台以上の SMR ベースの機器を使用した単一細胞質量データの収集、下流の画像分類、d 統計を含む薬物検査パイプライン全体の概略図分析、応答呼び出し、結果レポート。

このパイプラインを使用すると、ここで実証されているように、さまざまな細胞株でさまざまな作用機序を持つ 60 種類の薬剤について用量依存的な質量反応を示し、治療後 24 時間以内に幅広い治療法をテストできます。さらに、我々は、日常的な臨床ケアの一環として一般的に収集されるいくつかの異なる低侵襲腫瘍標本の形式に対してこれらの測定を実行する実現可能性を実証します。これらには、血液、骨髄、細針吸引物 (FNA) などの低入力検体、胸水などの悪性液体が含まれます。まとめると、これらの結果は、画像注釈付きの単一細胞質量測定に基づく検査が幅広い用途を提供する可能性があり、翻訳に関連する臨床検体の生物学的複雑性に対して堅牢であり、臨床的に実行可能な時間枠で実行できることを示しています。

適切な統計的有意性を持って治療に対する細胞質量反応を捕捉するために、我々は SMR のフロースルー形式を利用し、単一細胞の質量測定を可能にしています 23、24、25、26、27。 SMR センサーは、統合された U 字型のマイクロ流体チャネルを備えた吊り下げられたカンチレバーで構成されています 28 (図 1c)。細胞が統合チャネルを通過すると、カンチレバーの質量が一時的に変化し、この論文 (方法) を通じて「質量」と呼ばれる細胞の浮力質量に比例する共振周波数の短い変化が引き起こされます。機器に実装された流体制御スキーム（補足図2）とSMRチップを併用すると、50μlの体積から5000個の細胞のサンプルを10分間で一貫して測定できます。

患者検体からの治療反応を測定するには、まずサンプルからがん細胞を単離し（図2a）、等分した細胞を薬物または薬物の組み合わせとともにインキュベートします（方法）。次に、細胞集団を質量センサーに流し、細胞質量の確率分布関数を捕捉します。この関数をこの論文では質量分布と呼びます。例として、図 2a は 3 つの異なる質量分布、つまりビヒクル処理細胞の参照分布 (灰色) と薬物処理細胞の 2 つの分布 (青と紫) を示しています。統計的類似性の測定であるアースムーバーズディスタンス (EMD) を使用して、処理した細胞の分布を参照細胞の分布と比較し、その差を「質量応答」シグナルとして定量化します (図 2b、方法)。発散する質量分布 (より高い EMD 値、青色と灰色) ではより大きな質量応答を測定し、質量分布が類似している場合 (より低い EMD 値、紫と灰色) ではより小さな質量応答を測定します。さまざまな種類の腫瘍検体に使用できる悪性度に依存しない測定基準を実現するために、各単一細胞質量測定値をサンプル中のビヒクル処理細胞の平均質量で正規化し、その結果、質量変化を報告する単位のない質量応答シグナルが得られます。（パーセントで）対照と比較した（図２ｂ）。

a まず、単離されたがん細胞に投与し、試験対象の薬剤 (青と紫) またはビヒクル処理した対照 (灰色) とともにインキュベートします。各集団からの個々の細胞の質量を SMR 装置で測定し、処理細胞 (青と紫の曲線) と未処理の参照細胞 (灰色の曲線) の質量分布を決定します。 b 処理細胞と参照細胞の質量分布を比較して、処理に対する質量応答を決定します。質量応答信号は、Earth Mover's Distance (メソッド) によって計算された 2 つの質量分布間の統計的距離です。 2 つの類似した分布 (紫と灰色) を比較すると、より小さな質量応答シグナルが得られますが、発散する分布 (青と灰色) を比較すると、より大きな質量応答シグナルが得られます。 c 質量応答テストの構造を示す概略図。ビヒクル処理対照細胞は、試験対象の薬剤で処理される細胞の前後両方で測定されます。このアプローチにより、2 つの対照集団 (基準対対照) 間のベースライン質量応答シグナルの測定が可能になり、インビトロ効果による起こり得る時間変化する質量変化を捕捉できます。 d (a) および (b) に示すコントロール細胞と処理細胞の質量応答シグナルを示す質量応答プロット。各点に重ねられた線として示される 95% 信頼区間は、単一細胞質量データを使用したブートストラップによって計算されます (方法)。 p 値は、TEST と CTRL の質量反応の大きさの差を 3% の「決定限界」閾値と比較することによって決定されます (方法)。 * は p < 0.05 を示し、ns は p > 0.05 を示します。

他の集団ベースの統計検査と同様に、質量反応測定の精度は、サンプリングされた細胞集団が腫瘍サンプル内の真の分布をどの程度正確に表すかに依存します。センサーノイズや測定された細胞数などの質量測定パラメーターの影響を理解するために、図2aに示すデータを使用してシミュレーションを実行しました（補足図3a、b）。質量分布を計算するために少なくとも 2500 個の細胞を測定すると、同一サンプル間の質量応答シグナルのベースラインノイズが 1.5% 未満に制限され、質量応答の標準偏差が 1% 未満に制限されます。一方、測定がサンプルに基づいている場合は、 500 個のセルの場合、これらのパラメーターはそれぞれ 3 % と 1% です。

患者検体の固有の生物学的不均一性により、サンプル内の単離された単一細胞は異なるレベルの治療反応を示す可能性があります。したがって、信号の直線性は、治療によって引き起こされる質量変化を、サンプル、薬剤、治療用量間で比較できる線形質量応答に正確に変換するための重要な属性です。実証として、図2aに示す処理分布と参照分布から異なる比率で細胞をサンプリングすることにより、さまざまな大きさの質量反応をシミュレートします。質量応答シグナルがサンプル中の応答細胞の比率の線形関数であることを示します（補足図3c）。

機能検査の主な目標は、理想的には 48 時間未満の短いタイムスケールで測定を実行できるようにし、検査対象の原発がん細胞の表現型の変動や生存率の変化の影響を最小限に抑えることです。正確で信頼性の高い治療反応結果を保証するために、質量測定中の表現型の変動を考慮して、ビヒクル処理細胞を処理細胞集団の前後で 2 回測定します。複数の条件をテストする場合、質量測定には数時間かかる場合があります。ここで紹介するほとんどの薬剤では、溶解にジメチルスルホキシド (DMSO) が使用されるため、DMSO (0.25%) 処理のみがビヒクル対照として機能します。 0.25% DMSOで処理した細胞の質量測定値は未処理の細胞と区別できず、細胞質量に対するDMSO単独の影響が最小限であることを示唆しています（補足図1）。図 2c は、測定アプローチの構造を示しています。まず、ビヒクル処理した細胞の集団を測定して、「参照」分布として使用します。次に、処理にさらされた細胞を測定します。薬物パネルを試験するための基準セルの後に、複数の治療「条件」を連続して測定できます。最後に、ビヒクル処理細胞の 2 番目の複製条件を「対照」として測定します。測定期間全体にわたるビヒクル処理細胞の処理に依存しない変化を定量化するために、ビヒクル処理対照分布と参照分布の間の質量応答を計算します（図2dのCTRL）。治療に対する細胞応答を定量化するために、薬物処理細胞とビヒクル処理参照細胞間の質量応答を計算します（図2dのTEST）。ブートストラップ 29 を使用して TEST 信号と CTRL 信号を比較し、信号の大きさの差が「決定限界」閾値よりも大きいことを確認すると、治療反応結果を解釈するための p 値が得られます (方法)。たとえば、図2dの青と灰色の点の間で測定された距離が、対応する低いp値を伴う決定限界よりも大きい場合は、試験された薬物で処理された細胞が、対照細胞と比較して有意なレベルで質量を変化させたことを示します。仮説を棄却する高い p 値は、代わりに治療に対する反応がないことを示します (図 2d の紫色の点)。この論文では、決定のスリーシグマ限界30をすべての測定値にわたる3％と定義します。これは、細胞集団から繰り返しサンプリングされた500個の細胞間の距離の標準偏差の3倍に相当します（補足図3a）。

私たちのアプローチの堅牢性をテストするために、時間の関数としての質量損失の形で細胞表現型のドリフトをシミュレートしました（補足図3d）。処理された細胞の応答を正確に捕捉するための測定の限界を特定するために、細胞の時間当たりの質量損失のさまざまな速度をテストしました。時間の関数として表現型ドリフトの線形速度を仮定すると、(対照と比較して) 5% の質量反応の大きさを正しく解決するには、ビヒクル処理細胞の表現型ドリフトが 10% 未満である必要があることがわかります。ここで報告した細胞株または初代標本について、この数値を超える表現型ドリフト率は観察されていません。それにもかかわらず、私たちのアプローチでは、CTRLシグナルとして示されているように、参照細胞と対照細胞の間の距離を監視することにより、重大な表現型の変動を特定することができます（図2d）。この距離が 10% より大きいことが判明した場合、表現型の変動が大きいため、検査は決定的ではないと結論付けます。

市販の細胞濃縮キット (方法) の有効性が高いにもかかわらず、処理された原発腫瘍標本には、目的の単一細胞に加えて生物学的破片や細胞凝集体が含まれることがよくあります。質量測定だけではこれらの異なる粒子タイプを区別できないため、この追加の物質は、質量分布における薬剤誘発性の変化を検出する能力を妨げる可能性があります。この課題に対処するために、私たちは質量センサーとインラインで明視野イメージングを実装し（図 1）、すぐ下流でリアルタイムの光学粒子検出を行い、画像キャプチャをトリガーしました。各質量測定値は、対応する明視野画像とペアになっており、CNN ベースの画像分類を使用して注釈が付けられます。この画像分類は 2 段階で行われます。まず、バイナリ CNN 分類器を使用して、どの単一細胞イベントを受け入れ、どの非単一細胞イベント (デブリや細胞集合体など) を拒否するかを識別します。受け入れられた各イベントは、さらに無傷または透過性の単一細胞として分類され、拒否された各イベントは、2つの追加のバイナリCNN分類器を使用して凝集体または破片として特徴付けられます（図3a）。

図 1 に示すワークフローで実装された複数ステップの画像分類アプローチの概略図。入力画像は、まずバイナリ CNN 分類器を使用して受け入れられるか拒否されるかに分類され、その後、受け入れられたすべての粒子が無傷か、または拒否されるかのいずれかに分類されます。透過性細胞と拒否されたすべての粒子は、2 つの追加のバイナリ CNN 分類器を使用して凝集体またはデブリのいずれかとして分類されます。挿入画像は各クラスを代表するものです。各二分決定ノードにリストされている括弧内のパーセンテージは、相互検証されたモデルのパフォーマンスを示し、それぞれ適合率と再現率の値をリストしています (方法)。 b 画像分類なしの細胞集団全体 (白色) と、凝集体 (紫色)、無傷の細胞 (灰色)、透過性細胞 (ピンク色)、または破片 (青色) として分類された集団内の粒子の質量分布を示すバイオリンプロット) ヒト肺がん細胞株モデル (PC9) およびヒト多発性骨髄腫細胞株 (MM1S) について。 c 単一細胞画像分類は、サンプリング誤差を低減することで質量応答信号のノイズを低減します。デモンストレーションとして、画像キュレーションの有無にかかわらず、測定条件から 1000 個の細胞をランダムに 100 回サンプリングし、画像キュレーションの有無に応じたサンプリング誤差を表すこれら 2 つのセット内の平均質量応答を計算します。これを、13 の異なる機器にわたる 3,222 の測定条件を含む、このホワイトペーパーに記載されているすべての測定について繰り返すと、画像キュレーションによりサンプリング誤差が平均 16.2% 減少することがわかります。画像キュレーションあり（灰色）となし（白色）の質量分布のペアの例が示されており、元の測定セットに細胞凝集体と破片の集団が存在することを示しており、これらは後に画像キュレーションプロセスによって除去されます。

さまざまな細胞株および原発腫瘍標本について収集された各クラスの手動で精選された画像を使用して CNN モデルをトレーニングし、さまざまな標本形式にわたって一般化可能性を確保しました (方法)。手動でキュレーションされた画像セットに適用すると、これらのモデルは相互検証された精度を達成し、画像クラスごとに 97% を超える値を再現します (図 3a)。

このトレーニングセットでは、小さな粒子状物質または繊維状物質を含む画像はデブリとして分類され、明確にセグメント化された細胞クラスターを含む画像は凝集体として分類されます。無傷で透過性の細胞の識別は、主に膜の完全性を失ったと考えられる細胞に見られるコントラストの低下に基づいています。明視野イメージングによって観察されたこのコントラストの損失は、機能する細胞膜を失った非生存細胞の核により接近しやすいDNA挿入色素であるDAPIのフローサイトメトリー評価と並行して収集された生存率データと一致しています（補足図）４）。

画像注釈付きの単一細胞質量測定の有用性は、異なるベースライン質量特性を持つ細胞株の各粒子クラスの質量分布を比較するとわかります（図3b）。ヒト肺がん細胞 (PC9) とヒト多発性骨髄腫細胞 (MM1S) は、根本的な質量分布が大きく異なります。このばらつきを考慮すると、ユニバーサルゲーティングに基づいて単一細胞とデブリまたは凝集イベントを識別するために質量測定のみに依存することは、さまざまな細胞タイプにわたって実行可能ではありません。対照的に、画像のアノテーションと分類は、これら 2 つの細胞株で観察された粒子クラス全体の一貫した質量傾向からわかるように、さまざまなサンプルにわたって目的の粒子を識別する広範に適用可能な手段を提供します。細胞凝集体は最大の質量を持ち、次に無傷の細胞凝集体が続きます。細胞、透過性細胞、および破片。この柔軟性により、特定の標本の質量分布の基礎となる構造に関係なく、さらなる分析のための単一細胞の同定が可能になります。単一細胞の質量分布を特徴付けるこの改善された能力は、治療反応を確実に特定するための重要な要件です。リンクされたイメージングの利点を定量化するために、ある条件で収集されたすべての質量測定値、または画像分類によって受け入れられると注釈が付けられた質量測定値のみから抽出された細胞のランダムなサブセット間のサンプリング誤差を比較しました（図3c）。さまざまな初代細胞および細胞株について収集された 3,222 個の異なるデータセットにわたって、画像キュレーションによりこのサンプリング変動が大幅に改善され、同じ条件からのキュレーションされていない測定値と比較した場合、サンプリング誤差が平均 16.2% 減少することがわかりました。興味深いことに、各クラスを個別に考慮した場合、「集合体」イベントは「破片」イベントよりも多くのサンプリング誤差を説明しているようです（補足図4b、c）。これらの結果は、特に測定値の限られたサブセットのみが単一細胞である非常に不均一な標本の状況において、基礎となる質量分布のサンプリングの信頼性を向上させるリンクイメージングの能力を実証しています。

治療に反応して起こる可能性のある細胞量の変化を考慮する場合、薬物の作用機序 (MOA) に関連する 3 つの潜在的なカテゴリーを定義します: (1) 細胞周期停止による変化、(2) 代謝プロセスの中断による変化、（3）細胞の構造的完全性の欠陥による変化（図4a）。それぞれのタイプの薬物応答メカニズムの性質に関する基本的な一連の仮定を使用して、単一細胞の集団全体で予想される質量の変化を示す単純なモデルを作成できます。細胞周期停止の場合、質量分布は、G0/G1停止の場合は平均新生児細胞質量付近、G2/M停止の場合は分裂前の平均細胞質量付近に徐々に統合されることが予想されます（図4b）。これまでの研究では、代謝経路の破壊が単細胞質量の変化として現れる可能性があることが示されています 31。これらの効果は、図4bに概略的に示されているように、同化または異化のプロセスに偏り、それぞれ細胞が大きくなったり小さくなったりする可能性があります。細胞の構造的完全性の破壊は、集団全体で最大の質量変化を引き起こすと予想されます。これは、このカテゴリーが細胞のアポトーシスおよび/または壊死と一致しており、質量損失は、細胞の喪失などの細胞への劇的な物理的変化によって引き起こされる可能性が高いためです。膜の完全性/細胞質、膜の水泡形成、細胞の断片化、その他のプロセス。ここで、大量の質量損失により、細胞が最初のビヒクル処理分布から最小限の重なり合いの二次分布にシフトすると仮定します（図4b）。

異なる作用機序 (MOA) による治療は、異なる特徴的な質量反応サインを誘発します。 (a) に示すように、これらの MOA シグネチャは、細胞周期の停止、代謝の混乱、または構造的完全性の喪失を含む 3 つの一般的なカテゴリに大まかに分類できる薬物効果を捕捉します。 b G1 停止、G2 停止、カタボリックスキュー、アナボリックスキュー、または細胞膜によって引き起こされる、対照集団 (灰色の塗りつぶし、点線) と薬物治療集団 (赤色の塗りつぶし、実線) の間の質量分布の変化の概略図損失。 c 薬物治療に応答した実験的な質量分布変化の例は、(b) のすぐ上に示した各概略結果に対応します。 d 3つの異なる機器で収集された質量応答測定値（2500細胞の5000個のランダムサンプルによって定義される各システムのEMDの95％信頼区間に対応するエラーバー付きの個々の点）。上記の（c）に示された実験データに対応します。

ここで説明する MOA を持つ薬剤は、これらの薬剤に反応する均質な細胞株と同様にかなり一般的であるため、これらの仮説モデルをテストすることができます。 G0 / G1停止の質量反応結果をテストするために、ヒト肺がんH1666細胞株をMEK阻害剤である10μMのトラメチニブに17時間曝露しました。これにより、初期G1でほとんどの細胞が停止します（補足図5a）32。予想と一致して、細胞質量分布が対照と比較して下方にシフトしていることがわかりました（図4c、d）。対照的に、細胞分裂を防ぐ微小管阻害剤である10 nMのドセタキセルでMDA-MB-361細胞を24時間処理すると、質量の有意な上方シフトが観察されます（図4c、dおよび補足図5b）。これら 2 つの細胞周期停止表現型は、標的阻害剤と化学療法の両方の多くの薬物の活性の中心であり、集団反応は多くの例にわたってこれらの表現型を確実に解決します（補足図 6）。代謝の偏りデータを作成するために、リボソーム阻害剤であるシクロヘキシミドまたはプロテアソーム阻害剤であるカーフィルゾミブで細胞を処理して、代謝をそれぞれ異化または同化に偏らせました。 400 nM シクロヘキシミドで 24 時間処理した L1210 細胞では、タンパク質生合成の阻害と一致して、集団内の平均細胞質量の減少が観察されました 33。 50 nMのプロテアソーム阻害剤カーフィルゾミブで6時間処理したU266細胞を見ると、代わりに、下流の細胞毒性前の過剰なタンパク質の蓄積と一致して、細胞の平均質量のわずかな増加が観察されます（図4c、d）34。最後に、完全な構造破壊の例として、0.5% Tween 20 界面活性剤で 10 分間処理した L1210 細胞を使用しました。これにより細胞膜が透過化され、それ以外の健康な細胞集団に 40% でスパイクインされます。ここでは、生細胞を表す主な質量ピークの減少と、透過処理された細胞を表す小さなピークの増加が観察されます（図4c、d）。質量分布に対するこれらと同じ変化は、臨床的に関連する薬剤によって誘発された細胞死後の細胞でも観察できます（補足図7）。

質量分布はこれらの異なる応答プロファイルを識別できるため、不均一な一次サンプルにおける薬物応答の検出に適しています。これらの質量変化メカニズムの動的な性質は、細胞応答のタイミングの不均一性および生体外での潜在的な表現型ドリフトと相まって、これらのメカニズムの提示が細胞集団全体で必ずしも均一ではないことを意味します。たとえば、ドキソルビシンで処理されたPC9細胞などの同種の細胞株であっても、単一時点での薬物の異なる用量は、細胞周期停止と構造破壊の両方から単独または同時に質量応答シグナルがどのように現れるかを示しています（補足図） .8）。

臨床パイプラインにおける質量反応測定の役割を考慮する場合、さまざまな薬剤機構との適合性に加えて、薬剤感受性が低下する生体外での表現型安定性の時間枠が限られている異種腫瘍細胞標本との適合性を実証することも重要です。評価される。したがって、薬物の濃度と時間の影響、および質量反応の読み取り値に対する根底にある反応の不均一性を評価することが重要です。

薬物感受性を用量と時間の関数として特徴付けるために使用される標準的なアプローチは、生存率に基づく用量反応曲線または IC50 曲線です。そのため、さまざまな生存率マーカーと技術 (MTT、ATP、フローサイトメトリーなど) は、がん治療のための機能的バイオマーカーとしての可能性を示していますが、原発腫瘍サンプルの状況におけるこれらのアプローチの影響は、多くの場合、数によって制限されてきました。必要な細胞数とこれらのアッセイの実施に必要な時間1。ただし、確立された標準として、IC50 曲線は、細胞薬物応答に影響を与える変数を理解するための有用な比較材料およびモデルを提供します。 IC50 測定では、用量空間をスイープして、薬物に反応して大部分の細胞が死滅する用量変曲点を定義します。生存率に基づく用量反応を評価するための最適な時点は、通常、薬剤のメカニズムと研究対象の細胞株によって決まります。速効性の薬剤の場合、多くの場合、細胞の感受性を正確に定義するには 24 時間の時点で十分です。ただし、遅効性の薬剤（例、細胞周期停止を通じて機能する薬剤）の場合は、72 時間以上の時間が必要な場合があります。

これらの用量濃度とタイミングパラメータが細胞質量応答にどのように影響するかを評価するために、細胞株でこれらの変数を独立して調整し、その効果を理解しました。一定範囲の濃度のカーフィルゾミブで一定時間（15時間）処理したMM1S細胞は、同じ細胞株で収集したIC50曲線と同様の用量依存的な質量反応を示しました（図5a）。また、固定濃度の薬物に応答して質量反応が時間の経過とともに変化することにも注目しました（図5b）。細胞毒性を急速に誘導する速効性薬剤の場合、質量反応の大きさは、同様の時点で収集された生存率損失の測定値と一致する用量依存性を示します（図5cおよび補足図9a、b）。ただし、細胞死の前にシグナルを検出できるため、質量応答は、正確なIC50シグナルを定義するために必要な50％の生存率の損失よりもかなり前に遅効性薬物の効果を検出できます（図5dおよび補足図）。 .9c、d)。たとえば、パクリタキセルで処理した PC9 細胞の場合、試験したすべての濃度で観察された生存率の変化は最小限であり、IC50 測定には 72 時間を必要としたにもかかわらず、24 時間の質量測定により、薬物の有効濃度を明らかにする用量反応変曲点が正確に定義されます。より正確な読み出しが可能になります (図 5d)。この比較を、12の異なる細胞株で試験した60の異なる薬剤にわたって行うと、この急速に現れる質量応答シグナルの値が明らかになります（図5eおよび補足データ1）。標的キナーゼ阻害剤であれ化学療法であれ、多くの薬剤では、24 時間の IC50 値は、生存率測定で観察されたものと同じか、わずかに低い用量の薬剤で発生する質量ベースのシグナルを伴う、測定された質量反応と同等です。しかし、細胞周期停止などのよりゆっくりと作用するメカニズムを介して作用する薬剤の場合、24 時間の質量反応測定は依然として有効薬剤濃度を定義しますが、24 時間の IC50 測定ではほとんど展望が得られません。代わりに、そのような薬物に対する細胞感受性を定義するには、72時間以上のIC50タイムポイントを取得する必要があります（図5e）。細胞表現型における薬物誘発性の変化を迅速に検出するこの能力は、表現型のドリフトやエクスビボでの生存率の損失により長期間の薬物インキュベーションが不可能な一次組織測定の状況において特に有益です。

質量応答シグナルは、細胞生存率の測定と同様に、用量または測定のタイミングの変化によって変化します。カーフィルゾミブで処理したMM1S細胞の質量応答は、15時間の時点での用量を変化させた場合、または150 nMの用量で変化した時点で示した。複数の点は独立した機器を示し、重ねられた線は、2500 個の細胞の 5000 個のランダムサンプルによって定義される質量応答の 95% 信頼区間を示します。 c 速効型薬剤ベネトクラクスで 15 時間処理した MM1S 細胞、および遅効型薬剤パクリタキセルで 24 時間処理した PC9 細胞。質量で測定した用量反応を比較（赤軸、赤四角は代表的な質量反応測定値を示し、重ね合わせた線は 95% 信頼区間を示します)、または DAPI とアネキシン V を使用したフローサイトメトリーに基づく生存率の評価 (青軸、青丸、重ね合わせた線は 95% 信頼区間を示します) (方法)。 e 60の異なる薬剤に対する細胞株の質量反応（上の凡例）を示すヒートマップ。ランク付けされた用量に対する反応の大きさ（赤色の勾配；対照条件と試験条件の差によって決定される）を24時間IC50（黒色）と比較している。線）または長期 IC50 値（白丸）。長期 IC50 値は、24 時間 IC50 が無限であるか、試験に使用可能な最高濃度を超える薬物についてのみ提供されます。薬剤は、24 時間の IC50 値に関して X 軸に並べられています。特定の細胞/薬物の組み合わせについて、短期および長期の IC50 測定値を下回る用量で観察可能な質量反応は、提示されたすべての薬物について質量変化が生存能力の損失に対応するか、または生存能力の損失に先行することを示します。 *** は p < 0.001 を示し、ns は p > 0.05 を示します。

均質な細胞株は、質量反応測定の基本的な特性を調べるための優れた背景を提供しますが、原発腫瘍標本に見られる不均一性の良い代用とはなりません。このため、質量応答測定に対する不均一性の影響を評価することが重要です。この変数は、同じ細胞株からの薬物処理画分とビヒクル処理画分を混合することによって明示的に調べることができ、所定の時点で質量応答が応答する細胞の画分に比例して増加することが実証されています（図6a）。一次サンプルにおける不均一なサイズ分布と薬剤感受性をエミュレートするには、より複雑なモデルが必要です。この不均一性を念頭に置いて分別感度をテストするために、それぞれが個々の薬物に対して独自の感受性を持つ 3 つの細胞株の混合物を使用しました (図 6b)。 1 剤と 2 剤または 3 剤の組み合わせを使用して反応を観察すると、単剤療法としての各薬剤の反応のおおよその合計に相当する質量反応の相加的な変化が見られます (図 6b)。

a MM1S 細胞で行われた質量応答測定。ここでは、ビヒクル対照細胞とカーフィルゾミブ処理細胞を処理後に混合して、応答細胞の定義された画分を含む細胞集団を作成しました。 b 単剤、二剤、または三剤療法のいずれかで 15 時間処理した MM1S、H929、および KMS-12-PE 細胞の 1:1:1 の組み合わせ。細胞の感受性の高い画分が増加するにつれて相加的なシグナルが見られることを示しています。併用療法に応じて。複数の点は独立した機器を示し、重ねられた線は、2500 個の細胞の 5000 個のランダムサンプルによって定義される質量応答の 95% 信頼区間を示します。 *** は p < 0.001 を示し、ns は p > 0.05 を示します。

これらの結果は、質量反応測定と他の既存の薬物反応アッセイとの間の高度な一致を実証し、質量反応が時間、用量、およびサンプルの不均一性の影響を正確に特徴付けることができることを示しています。単一細胞の質量応答測定によって提供されるより高い情報量と、生存率損失の上流のより早い時点で細胞感受性を解決する独自の能力は、ex vivoでの細胞の長期維持が現実的ではない原発腫瘍細胞の特性評価において明らかな利点を提供します。

サンプルの組成と収集の実現可能性は臨床検体の形式によって大きく異なり、細胞の単離と測定の容易さに影響を与える可能性があります。したがって、機能検査パイプラインは、悪性腫瘍全体にわたる幅広い適用性を維持するために、さまざまな腫瘍細胞区画から収集された検体と互換性がなければなりません。

これまでの研究では、血液や骨髄などの血液悪性腫瘍サンプル形式の薬効を特徴付けるために質量応答測定を使用する実現可能性が実証されています 21。このような生物物理学的測定値が治療に対する患者の反応を正確に予測できるという心強い概念実証を提供する一方、固形腫瘍標本処理の技術的な複雑さにより、画像注釈付きの質量測定ワークフローが薬物感受性を特徴付ける能力を維持できるかどうかをテストすることになりました。また、臨床検査パイプラインに必要な速度、堅牢性、技術的な再現性も提供します（補足図 2b）。

このワークフローと血液腫瘍検体との互換性を最初に実証するために、形質細胞白血病 (PCL) 患者の末梢血サンプルと多発性骨髄腫 (MM) 患者の骨髄穿刺液の測定結果を示します (図 7a)。、b）。どちらの場合も、さまざまな治療法に対して細胞質量反応が観察されました。 t(11;14)転座が事前に実証されているPCLサンプルから単離された腫瘍細胞は、ベネトクラクスの単独療法およびボルテゾミブおよびセリネキソールとの併用療法に対して用量依存的な反応を示しました。しかし、これらの細胞はセリネキソールまたはボルテゾミブ単独に対して有意な質量反応を示さず、この反応が主にベネトクラクスによって引き起こされたことを示唆しています。この患者は以前にベネトクラクスベースの治療を受けており、その後の診断用骨髄生検で t(11;14) クローンが根絶されたことから示されるように、良好な反応が 5 か月間持続しました。しかし、副作用（血球減少症）のため、治療は 5 か月後に中止されました。髄外病変が知られている再発性/難治性の多発性骨髄腫患者からの骨髄穿刺サンプルは、セリネキソール、カーフィルゾミブ、デキサメタゾンの組み合わせ、および DCEP 療法の組み合わせ (デキサメタゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シスプラチン) に対して用量依存的な反応を示しました。）。単剤療法として投与した場合、併用療法で観察された集団反応のほとんどは、代謝されたシクロホスファミドと同じ 2 つの成分を生成する自発的に加水分解する化合物であるシクロホスファミドの類似体であるマホスファミドの投与によって再現されました 35。多発性骨髄腫における以前の予測測定と同様に、DCEP 質量反応測定は、患者の血清モノクローナルタンパク質の減少およびサルベージ併用化学療法による治療に対する反応と一致しました。

質量反応測定は、a 末梢血サンプルから単離され、リストされた薬剤で 15 時間処理された形質細胞白血病 (PCL) 細胞、b 骨髄穿刺サンプルから単離され、リストされた薬剤で 15 時間処理された多発性骨髄腫細胞について収集されました。、c 細胞は、それぞれ非小細胞肺がん、黒色腫、乳がんの 3 人の異なる患者の肺塊、頸部塊、および軟部組織の骨塊から採取された細針吸引 (FNA) サンプルから単離され、治療を受けました。リストされている薬剤で 20 時間処理され、 d 胸水サンプルから単離され、リストされている薬剤で 20 時間処理された非小細胞肺がん (NSCLC) 細胞。すべてのプロットについて、各点は個々の機器で測定された質量応答を表し、エラーバーは 2500 個の細胞の 5000 個のランダムサンプルによって定義される質量応答の 95% 信頼区間に対応します。 *** は p < 0.001 を示し、** は p < 0.01 を示し、* は p < 0.05 を示し、ns は p > 0.05 を示します。

再発または転移性の固形腫瘍悪性腫瘍の患者の場合、臨床評価では、血液や骨髄検体ではなく固形組織サンプルの収集が必要になることがよくあります。転移病変の大きさと解剖学的位置、そして不必要な侵襲的処置を避けたいという要望を考慮すると、外科的切除や場合によってはコア生検によるこれらの標本の収集は実行不可能です。細針吸引（FNA）は、コア生検と比較して薄型の針を使用するため、サンプル収集に代わる低侵襲性の代替手段となり、出血や損傷のリスクを軽減します36。最大限の臨床的有用性を確保するために、我々はこれらの低入力 FNA 検体を使用して質量応答測定を実行する実現可能性を判断しようとしました。これらの低入力 FNA 検体では、下流分析用の単一細胞が数万個しか得られないことがよくあります。

私たちは、3 つの異なる解剖学的位置から FNA 標本を収集しました。非小細胞肺がん (NSCLC) 患者の肺腫瘤、黒色腫患者の頸部腫瘤、および乳がん患者の軟部組織溶解性骨質量 (図7c)。総細胞収量は、肺、骨、首の塊に対してそれぞれ 115、25、および 120 千個の腫瘍細胞でした。これらの標本は、一連の細胞質量の薬物反応を示し、肺質量はパクリタキセルとゲムシタビンに対して顕著な質量反応を示し、頸部質量はダブラフェニブとトラメチニブの組み合わせに対して有意な質量反応を示し、軟部組織の骨質量は有意な反応を示さなかった。ドセタキセルまたはドキソルビシンに対する反応。興味深いことに、NSCLC患者はその後カルボプラチンとパクリタキセルの組み合わせで治療され、この検体で記録されたパクリタキセルに対する集団反応と一致する顕著な臨床反応を示した。これらの測定値は、低入力組織フォーマットでエンドツーエンドのワークフローを実行する実現可能性を実証しており、このパイプラインが進行性固形腫瘍悪性腫瘍患者に対する現在の臨床管理戦略の制約内で薬物反応検査の実行に適合していることを示しています。

播種性転移病変に加えて、進行がん患者の多くは胸水や腹水の形で悪性体液を蓄積しており、これは重大な不快感を引き起こすため、症状を管理するための診断および治療上の理由から排出する必要があります37。これらの悪性体液には腫瘍細胞が含まれているため、低侵襲の薬物反応検査に別の潜在的な検体フォーマットを提供します。標準的な腫瘍細胞濃縮プロトコール (方法) の後、これらのサンプルから測定用に相当な数の細胞が得られることがよくあります。たとえば、進行性非小細胞肺がん患者の場合、150 ml の悪性胸水サンプルから約 1 億 7,000 万個の腫瘍細胞が生成され、これは一連の薬剤の質量反応検査を行うのに十分以上です (図 7d)。この患者は、MET エクソン 14 スキッピング変異が確認されたためカプマチニブによる治療を受けていましたが、胸水採取時にはこの治療に反応していませんでした。滲出液サンプルから単離された腫瘍細胞について収集された質量反応測定は、この臨床結果と一致しており、数桁にわたる用量にわたってカプマチニブに対する有意な質量反応がないことが明らかになりました。ただし、これらの細胞は一般にすべての治療に対して無反応だったわけではなく、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチンなどの治療に対して、さまざまな規模の有意かつ用量依存的な質量反応を示しました（図7eおよび補足図10a）。パクリタキセルやドセタキセルを含む、より遅効性のタキサン系薬剤の細胞株測定と一致して、これらの薬剤で検出された質量反応は、この同じ標本について収集されたフローサイトメトリーに基づく生存率測定では観察できませんでした（補足図10b）。これらの結果は、悪性体液検体を用いた質量反応測定の収集の実現可能性を実証し、原発腫瘍細胞を直接測定することによって明らかにできる薬物反応の不均一性の一例を提供する。さらに、この新しいアプローチが既存のゲノムバイオマーカーを補完する可能性を示していますが、この患者の場合のように、必ずしも有効な治療法が特定されるわけではありません。

ここで紹介するワークフローは、がんに対する機能的精密医療における最近の取り組み 10、11、12、13、14、15、16、17 に基づいており、臨床がんケアに広く適用できる迅速な治療ガイダンスに向けた重要な追加のトランスレーショナル開発を提供します。当社は、血液や骨髄などの血液悪性腫瘍の研究で一般的に使用されるものに加えて、FNA などの固形腫瘍や悪性体液のサンプリングに使用される、細胞希釈された低侵襲性の検体フォーマット全体で薬物反応測定を収集できる可能性を実証しました。。測定キュレーションのための画像分類や統計的アプローチなど、ここで説明する技術的改善は、不均一で不安定な一次サンプルからの限られた数の細胞を使用して治療反応を特定するのに役立ちます。これらの進歩によって可能になった一次サンプルのバックグラウンドノイズの低減は、反応を観察するために必要な薬物曝露期間を制限することにより、試験の所要時間を 2 日に短縮するのにも役立ちます。

さまざまな悪性腫瘍や検体形式にわたる幅広い有用性を実証することに加えて、このワークフローを使用して幅広い治療法に対する集団反応を特定できることも示しました。独特の作用機序と細胞の生物物理学的特性に対する異なる影響にもかかわらず、単一細胞質量の測定により、ここで試験したすべての主要な薬物クラスについて細胞株における用量依存的な応答を特定することができました。さらに、いくつかの例外を除いて、これらの質量反応は 24 時間以内に観察可能であり、多くの場合、代替の生存率に基づく測定で有意なシグナルが検出される前に観察されました。代謝拮抗剤の5-フルオロウラシルなどの非常に遅効性の薬剤の場合、質量反応は治療後約48時間まで観察できませんでしたが、これはフローサイトメトリーで評価した細胞生存率の観察可能な変化に先行しました（補足図9c）。まとめると、これらの結果は、質量反応測定が、既存のゴールドスタンダードの生存率ベースの薬物反応アッセイと同等の一般化可能性を提供しながら、多くの状況においてより迅速な反応読み出しを可能にすることを示唆しています。 ex vivo では表現型の急速な変動が起こります 38,39。

他の薬物反応測定アプローチと同様に、迅速な治療ガイダンスに質量反応を使用することには一定の制限があります。たとえば、このワークフローでは腫瘍細胞の単離と薬剤投与のアプローチが使用されているため、腫瘍細胞固有の作用機序を備えた薬剤の特性評価に最適化されています。生理学的リモデリングを必要とする抗血管新生薬（例：ベバシズマブ）や、ホルモン受容体陽性がんを間接的に標的とする内分泌療法（例：アロマターゼ阻害剤）など、主に非細胞固有の手段を通じて作用する治療法は、現時点ではこのワークフローと互換性がありません。。ただし、チェックポイント阻害剤などの免疫腫瘍学薬を含む特定の治療法では、効果的な薬物反応測定を実装するためにそれほど重要ではないパイプラインの変更が必要な場合があります。これらの治療法は非腫瘍細胞固有の機構を通じて作用するにもかかわらず、これまでの研究では、単一細胞の塊からも免疫細胞の機能状態を読み取ることができることが実証されています 21,22。ここで紹介するワークフローは、これらの免疫細胞固有の薬物効果の直接測定に適しています。

この質量測定パイプラインの単一セルの性質により、さらなる技術的機会が提供されます。たとえば、ここでは粒子分類と質量測定データの品質向上のためにリンクされたイメージングが使用されていますが、このプラットフォームによって提供される光学的アクセスは、特徴抽出のための明視野画像分析や免疫表現型検査のための蛍光検出など、追加のリンクされた単一細胞読み出しアプローチと互換性があります。。流体処理の開発と組み合わせると、これらの光学的改善により、将来のバージョンのアッセイで必要な細胞数が減少する可能性があります。非破壊的方法として、これらの単一細胞質量測定値は、ペアの scRNA-seq22 で以前に実証されているように、リンクされたマルチオミック単一細胞分子読み取り値の上流で収集することもできます。同様に、原発腫瘍標本について収集された質量反応測定値を使用して、同じ患者について収集されたゲノム結果を補完することができます。同時に、予測精度を向上させるために、または下流で特定のゲノム変化に最適な阻害剤を選択することができます。いずれの場合でも、単一細胞質量の測定は、治療反応の機能的評価を提供し、薬剤感受性の根底にある生物学的決定因子をさらに解析することにより、臨床上の意思決定と抗がん剤開発の両方に大きな潜在的利益をもたらします。

広範な悪性腫瘍と薬物メカニズムを対象とする機能検査として、このアプローチには独特の課題があります。たとえば、特定の一次検体に対して可能な薬物反応検査の範囲は、処理後に利用可能な腫瘍細胞の総量に大きく依存します。したがって、図7および補足図11からわかるように、テストされる条件の数は1から25を超えるまでの範囲に及ぶ可能性があります。この細胞収量は、標本の形式や個々のサンプルによって大きく異なり、薬物パネルを設計する際の重要な考慮事項です。さまざまな種類のサンプルをテストします。一次検体から単離された腫瘍細胞は、サンプルごとに純度や生存率が大きく異なる可能性があり、このワークフローを臨床的に実装する際のもう 1 つの重要な考慮事項です (補足注 1)。

これらの一次検体について収集された集団反応データの解釈も、このアプローチが臨床に移行する際の開発上の重要な焦点です。ここでは、統計的距離比較に基づく応答と非応答の単純な二値評価に焦点を当ててきましたが、今後の研究では、深さまたは耐久性を把握する際に、応答の大きさやその他の単一細胞質量分布の特徴を考慮する価値に焦点を当てる予定です。臨床反応の。テストが臨床的に関連する反応と無反応を正確に識別することを保証するには、状況に応じた検証データセットが必要です。これらの薬物および悪性腫瘍に特有の決定仕様の制限は、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、および乳がんや肺がんを含む固形腫瘍を対象とした進行中の複数の前向き研究の焦点です（NCT04985357 および NCT03777410）。ここで示した作業により、このテストを、これらおよび将来の臨床検証研究のための堅牢でスケーラブルな CLIA 認定ワークフローに組み込むことが可能になりました。

この臨床的実現可能性の実証は、薬物や悪性腫瘍に依存しない有用性、小さなサンプルサイズへの適合性、迅速な所要時間などの質量反応測定の基本特性に加えて、患者に対する機能検査の広範な臨床的影響に向けた重要な一歩を示しています。お手入れ。

我々は、SMR 技術を使用して、以前に提示したものと同様の方法 23,28 で、80 nl/s を超える流量および 0.5 pg 未満の質量精度で単一細胞測定を実行します。これまでの研究とは異なり、この研究で使用される測定セットアップは、SMR センサーと関連する流体工学を制御する統合機器です。この論文で示されているデータを収集するために、13 台の同一の SMR 装置が使用されました。各機器には、圧力および流量ベースの流体制御セットアップ、SMR チップを室温で安定に保つための温度コントローラー、SMR センサーとそれに類似したデータを制御するためのカスタム読み出しおよび駆動電子機器を備えた FPGA コントローラーが装備されています。 Olcum et al.40 で説明されているように、単一細胞が SMR を通過する際の画像を取得する画像ユニットと、制御および分析ソフトウェアを実行するコンピューターです。プロトタイプ内の SMR とサブユニットは、LabView 環境で開発されたカスタムソフトウェアによって制御されます。ソフトウェアは、技術者を自動的に校正、流体プライミング、セル測定、洗浄の各ステップを順番にガイドします。洗浄ステップは、測定後の汚染を防ぐために、測定された各薬物状態の間に実行されます。機器の測定の設定とパラメータはすべての SMR 機器で同一であり、ローカルサーバーから制御ソフトウェアによって取得されます。さらに、制御ソフトウェアには、詰まりを防ぐためのフローキックバック、無駄を最小限に抑えるための自動サンプルローディング、速度と信頼性を高めるための洗浄ルーチンなどの自動ルーチンが装備されています。

この研究では、最初のワッサーシュタイン距離としても知られるアースムーバーの距離 (EMD) を使用して、質量分布の違いを「質量応答」として定量化します。 EMD は、直線性、並進不変性、対称性など、細胞分布の違いを定量化するための理想的な測定基準の特性 41 を備えており、機器のドリフト、測定ノイズ、またはその他の変動要因による分布の小さな違いに対して堅牢です 42。 Orlova et al.42 が示唆しているように、EMD は上記の要件をすべて満たしており、単一細胞質量測定のような 1 次元データを実行するのに計算効率が優れています 43。

質量応答信号を質量分布を比較するための正規化された無次元の測定基準として定義するには、次の表記法 (式 1) を導入します。

ここで、X と Z はそれぞれ薬物処理およびビヒクル処理した参照細胞のソートされた単一細胞質量測定値であり、\(N\) は各分布内の細胞の数です42。 (質量応答は、X と Z のサイズが異なる場合にも計算されます。上記の方程式では、簡単にするために両方に対して N を仮定します。)

細胞質量のガウス分布 (またはその他の既知の) 分布は期待できないため、ノンパラメトリックブートストラップ法を使用して質量応答シグナルの 90% 信頼区間を計算します。具体的には、BCa (バイアス補正および加速) 法を使用して、質量応答信号の全範囲にわたる正確なカバレッジ確率で信頼区間を推定します 44。この論文で報告されているすべての質量応答について、特に明記されていない限り、\(N=2500\) 細胞および質量応答信頼区間のブートストラップ反復数は \(R=5000\) です。

質量応答を測定するために提案された構造（図2c、d）により、統計的検定を使用して単一細胞の測定値を直接比較するのではなく、測定された質量応答シグナルの生物学的重要性をテストすることができます。各細胞集団を表すために測定される細胞の数 (\(N\)) は数千個のオーダーであるため、サンプリングエラー、機器のノイズ、または表現型のドリフトによる質量分布の小さな偏差が、統計的に有意であることが判明する可能性があります。ただし、そのような偏差は、生物学的に意味のあるシグナルを表すことなく、統計的に有意である可能性があります45。この問題を回避するために、図 2d に示すように、検定統計量 \(\theta\) を 2 つの質量応答信号、つまり CTRL と TEST の差であると定義し、 \(\theta\) かどうかを確認します。判定しきい値の限界を超えています。したがって (式 2):

ここで、\(Y\) はビヒクル処理した対照細胞のソートされた質量測定値であり、\(X\) および \(Z\) は上記のように定義されます。方程式の第 2 項は、異なる時点で測定された参照セルと対照セル間の距離です (図 2c)。したがって、試験統計量は、試験期間中の対照細胞の「表現型ドリフト」（存在する場合）に対する薬物処理細胞とビヒクル処理参照細胞との距離である。ドリフトがない場合でも、第 2 項は、同じ分布から 2 つの有限サンプル間の距離を推定する際に固有の自然発生ノイズを捕捉します。

治療に対するがん細胞の感受性をテストするには、シグナル \(\theta\) を、生物学的に意味のある「決定限界」である閾値 \({\theta }_{0}\) と比較します。評価されている薬物のクラス。一般に、ゼロ以外のヌルに対してノンパラメトリック仮説検定を行うのは困難です。 Chernick が述べているように、「仮説検定で特に重要なのは、漸近的に重要な統計を使用し、分布を帰無仮説の中心に置くことです」46。このステートメントと一致して、ここで概説されている bootstrap-t メソッドを使用します。 Davison et al.29 の導出を使用して、ピボット、つまり分布が基礎となるモデルから独立したデータとパラメーターの組み合わせ (式 3) を導入します。

ここで、 \(\hat{\theta }\) は観測された信号、 \(\theta\) は（観測不可能な）真の信号、 \(S\) は \(\hat{\theta }\ の標準誤差) です。）。この定式化では、 \(T\) は漸近的にガウス分布になります。ここで紹介する研究では、参照集団、対照集団、試験集団のそれぞれ \(N=2500\) 個の細胞から \(\hat{\theta }\) を測定します。 \(S\) は、\(\hat{\theta }\) の \(r=19\) ブートストラップレプリカントを使用して推定されます。

帰無仮説 \({H}_{0}:\theta \le {\theta }_{0}\) を検定するには、\(\theta\) を \({\theta }_{0}\) に置き換えます。 )、null の下で観測されるピボットの値は (式 4) になります。

仮説検定を行うには、\({t}_{{{{{{{\mathrm{obs}}}}}}}}\) を \(T\) のブートストラップシミュレーションと比較します (式 5) :

ここで、S* はブートストラップレプリカントの推定誤差 \({\hat{\theta }}^{* }\) です。 \({S}^{* }\) はやはりブートストラップによって検出されるため、「埋め込みブートストラップ」メソッドが存在します。 \({\hat{\theta }}^{* }\) の \(R=\,999\) 回の反復を使用し、それらのそれぞれについて \(r=\,19\) 回の反復を使用して \( {S}^{* }\)。

\(p\) 値、つまり帰無仮説が真である場合に観察された結果が得られる確率は次のようになります (式 6)。

ここで、 \(\Pr \left(x\right)\) は \(x\) が true である確率、 \(\#[{x}^{* }]\) は \ が該当するブートストラップバリアントの数です。 (x\) は真です。選択した反復回数 \(R\) で、達成可能な最小 \(p\) 値は 0.001 です。結果の \(p\) 値を通常の有意水準 5%、つまり \(p\,{{{{{\rm{value}}}}}} \, < \, 0.05\) と比較します。帰無仮説を棄却できるかどうかを判断します。

SMR 機器でさまざまな種類の細胞から収集された画像は手動で厳選され、各画像クラス (無傷細胞、透過性細胞、デブリ、凝集体) ごとに少なくとも 10,000 枚の画像のトレーニングセットが生成されました。次に、Python (3.7.7) の Keras ライブラリ (2.3.1) を使用して、3 つの異なるバイナリ分類 CNN モデルが生成されました。これらには、(1) トレーニング中に無傷細胞画像と透過性細胞画像の両方を「受け入れられた」イベントとして利用し、デブリと凝集画像の両方を「拒否された」イベントとして利用した受け入れ/拒否モデル、(2) 無傷/透過性モデル、(3)骨材/破片モデル。トレーニングでは、画像拡張を使用して最終モデルの堅牢性を向上させました。この拡張には、ランダムな垂直方向および水平方向の画像の反転、明るさの調整、回転が含まれます。各モデルは、厳選された各トレーニングセットの画像の 90% を使用してトレーニングされ、残りの 10% はモデルのパフォーマンスをテストするための相互検証に使用されました。この相互検証の精度と再現率を図 3 に示します。画像は 2 段階で分類され、最初に受け入れ/拒否分類器を使用し、次に受け入れられた粒子に無傷/透過性分類器でさらに注釈を付け、拒否された粒子に破片/破片/拒否の注釈を付けました。集計。

A549、PC9、MDA-MB-361、PA-TU-8902、HT-29、NCI-H1666、NCI-H2228、MM.1S、MM.1R、H929、U266、および KMS-12-PE 細胞は、ウシ胎児血清 (FBS; Sigma Aldrich、カタログ番号 F4135)、抗生物質抗真菌剤 (Gibco、カタログ番号 15240062)、および HEPES (Gibco、カタログ番号 15630080) を補充し、37 °C の加湿インキュベーター内で保存したベース培地、 CO2 5%。基本培地は、RPMI1640 + GlutaMAX (Gibco、カタログ番号 61870)、DMEM + グルコース + GlutaMAX (Gibco、カタログ番号 10566024)、または McCoy's 5A 培地 (ATCC、カタログ番号 302007) のいずれかでした。 H929 細胞は、2-メルカプトエタノール (Sigma、カタログ番号 97622) を補充した培地で培養しました。継代のために、メーカーの推奨に従って、接着細胞株を 0.25% トリプシン-EDTA (Gibco、カタログ番号 25200) で処理しました。 MSSM の Parekh Lab との共同研究の一環として入手した KMS-12-PE 細胞を除き、細胞株は ATCC、DSMZ、または ECACC から入手しました。すべての細胞株は毎月マイコプラズマ検査で陰性でした。

薬物は MedChemExpress または SelleckChem から凍結乾燥粉末として入手し、適切な溶媒で再構成し、長期使用のために単回使用のアリコートとして -80 °C で保存しました。質量応答アッセイでは、細胞を 2 × 105 細胞/mL で投与し、決定された薬物濃度で指定された期間投与しました。対照細胞には0.25% DMSOを投与しました(ビヒクル対照)。次いで、細胞を6または12ウェルの標準ポリスチレンプレートに播種し、指定された期間インキュベートしました。浮遊細胞株の場合、測定時に細胞を穏やかに再懸濁し、完全培地ですすぎ、300 × g で 5 分間遠心分離し、測定用培地に再懸濁しました。付着細胞株の場合、測定時に各ウェルの上清を回収し、ウェルをPBSですすぎ、0.25% Trypsin-EDTA (Gibco、Cat#25200)を7分間使用して細胞を剥離しました。次に、剥離した細胞を各ウェルの上清と合わせ、300 × g で 5 分間遠心分離し、測定用培地に再懸濁しました。単離した初代細胞を 24 または 96 ウェルのローバインドプレート (Corning: Cat# 3473) にプレーティングし、インキュベーション後、細胞を穏やかに再懸濁し、完全培地ですすぎ、300 × g で 5 分間遠心分離し、ろ過液に再懸濁しました。測定用の媒体です。

原発がん検体は、インフォームドコンセントの提供に基づき、IRB 承認のプロトコール (WCMC IRB # 0010004608、ISMMS IRB # STUDY-18-00456、CSHRI IRB # 1738582-3) に従って患者から収集されました。一次サンプルが収集されると、荷送人は処理のために一晩中トラベラ研究所に返送されました。すべての FNA および悪性体液サンプルは、4 ℃ (FedEx、標準持続時間冷却ユニット) に保たれた配送業者で出荷されました。細針吸引物は、輸送中の保存のために HypoThermosol (BioLife Solutions) に再懸濁されました。血液および骨髄検体は、上部が緑色のヘパリンナトリウム臨床検体チューブ (BD Vacutainer) に入れられ、温度を 15 ～ 20 °C に維持する制御された室温配送業者 (Inmark Life Sciences) で輸送されました。それ以外の場合、各荷送人は生物学的物質のカテゴリー B 出荷の規制に従って準備されていました。

血液および骨髄サンプルは、70 µm メッシュフィルター (pluriSelect) による上流濾過と、それに続く Ficoll 密度勾配遠心分離 (Sigma Aldrich) によって処理されました。次いで、単核細胞集団を、CD138+ または CD33+ 磁性マイクロビーズ (Miltenyi) を使用するポジティブ選択に供し、メーカーのプロトコールに従って AutoMACS Pro Separator (Miltenyi) を使用して分離しました。精製した細胞を、Glutamax および 10% FBS を補充した RPMI 培地に再懸濁しました。細針吸引サンプルを最初に赤血球溶解 (BD PharmLyse) に供し、続いて Miltenyi ヒト腫瘍解離キットを使用してメーカーのプロトコールに従って機械的および酵素的消化を行いました。次いで、Miltenyi ヒト腫瘍細胞単離キットを製造業者のプロトコールに従って使用して、腫瘍細胞を精製した。胸水サンプルも同様に、最初に赤血球溶解を行い、続いて同じ Miltenyi 腫瘍細胞分離キットを使用して MACS ベースの腫瘍細胞分離を行いました。 FNA 検体と浸出液検体の両方について、濃縮された腫瘍細胞を Glutamax と 20% FBS を含む DMEM 培地に再懸濁しました。

細胞の生存率応答は、CellTitre-Glo 2.0 (Promega、カタログ番号 G9242) を使用して評価し、発光はプレートリーダーによって定量されました。細胞は、細胞倍加時間に応じて、開始濃度 2 × 104 または 2 × 105 で、平底 96 ウェルプレート (Corning、カタログ番号 3903) に 3 回播種しました。薬物治療は 24 ～ 144 時間で評価されました。すべての測定は、製造元のプロトコルに基づいて実行されました。

すべてのフローサイトメトリー測定は、MACSQuant 10 サイトメーター (Miltenyi Biotec、カリフォルニア州オーバーン) で実行されました。データ解析はFlowJo(10.8.1)で行いました。細胞生存率は、アネキシン V (Biolegend、CAT# 640945) および 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、ジラクテート (DAPI) (Biolegend、CAT# 422801) で細胞を染色することによって評価しました。生存細胞は、 DAPI とアネキシン V の両方。フローサイトメトリーデータを質量データ（図 5 および補足図 9）と比較するために、2500 個の細胞のサブセットを各フローサイトメトリーデータセットから 1000 回ランダムにサンプリングして、細胞生存率の 95% 信頼区間を定義しました。読み上げ。次いで、これらの測定値を、３％の決定限界（質量応答測定について上述した）を使用して対照条件と比較して、ｐ値を決定した。フローサイトメトリーと質量読み取り値の間の応答の大きさを忠実に比較するために、質量応答測定の y 軸限界は、測定された細胞の対照集団内で「細胞」と「透過性」に分類された画像イベント間の質量応答を見つけることによって決定されました。各実験は、フローサイトメトリーによって決定された100％の生存率損失の代用として行われます（補足図4）。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。図のすべてのソースデータは補足データ 1 にあります。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04376-8

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著者らは、フィードバックと有益な議論を提供してくれた Scott Manalis と Keith Ligon に感謝したいと思います。この研究は、フェーズ I NCI SBIR 1R43CA228872-01A1 およびフェーズ II NSF SBIR 2026060 によってサポートされました。図は、BioRender.com を使用して生成されました。

Robert J. Kimmerling、Mark M. Stevens、Selim Olcum などの著者も同様に貢献しました。

これらの著者は同様に貢献しました: Anthony Minnah、Madeleine Vacha、Rachel LaBella。

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ロバート・J・キンマーリング、マーク・M・スティーブンス、セリム・オルカム、アンソニー・ミンナ、マデリーン・ヴァシャ、レイチェル・ラベラ、マシュー・フェリ、スティーブン・C・ワッサーマン、クリフォード・A・リード

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フアニタ・フジイ、ザイナ・シャヒーン、シュリヴィディヤ・スンダレサン

ワイル・コーネル・メディスン、ニューヨーク州ニューヨーク州、米国

ドリュー・リバデネイラ、デヴィッド・S・ジャヤバラン、ルーベン・ニースヴィスキー、カーラ・A・ローゼンバウム

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学医学部、血液学および腫瘍内科

サリタ・アグテ、アドルフォ・アレマン、サミール・パレク

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サリタ・アグテ、アドルフォ・アレマン、サミール・パレク

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学生物医科学大学院

アドルフォ・アレマン

米国マサチューセッツ州ボストンのダナ・ファーバー癌研究所腫瘍内科

ジョゼフ・A・クリスティエロ＆マーリーズ・R・ラスキン

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学プレシジョン免疫学研究所

サミール・パレク

米国ニューヨーク州マウントサイナイのアイカーン医科大学腫瘍科学科

サミール・パレク

米国カリフォルニア州レッドウッドシティ、パロアルト医療財団、血管およびインターベンション放射線科

アノーベル・タムラジ

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RJK、MMS、SO、MV、AM、RL、CAR が研究戦略を定義し、実験を設計しました。 RJK、AM、MV、RL が実験を行いました。 RJK、MMS、SO、AM、MV、RL、MF がデータ分析を実行しました。 RJK、MMS、SO、および SCW は、プラットフォームのハードウェアとソフトウェアを実装しました。 JF、ZS、SS、DR、DJ、SA、AA、JAC、RN、MRL、SP、CAR、および AT が管理する臨床検体の収集と出荷（患者の身元確認、患者の同意、出荷のためのサンプルの収集と梱包、患者の臨床注釈付けなど）。 RJK、MMS、SO は図を準備し、すべての著者からのフィードバックを得て原稿を書きました。

ロバート・J・キンマーリングまたはクリフォード・A・リードへの通信。

RJK、MMS、SO、CAR は、SMR 技術を臨床用途に商業化している Travera の創設者です。 RJK、MMS、SO、AM、MV、RL、CAR は Travera の従業員です。 MF、SW、AT は Travera からコンサルティング料を受け取ります。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Toril Holien と Gene Chong。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Kimmerling、RJ、Stevens、MM、Olcum、S. 他細胞量測定を使用した、悪性腫瘍および治療法に依存しない抗がん剤反応の評価のためのパイプライン。 Commun Biol 5、1295 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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受信日: 2022 年 6 月 1 日

受理日: 2022 年 11 月 16 日

公開日: 2022 年 11 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04270-3

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