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Jan 20, 2024

ベクトル構造光による光トラップと蛍光制御

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 17690 (2022) この記事を引用

1447 アクセス

2 引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

今回我々は、マイクロスケールのポリマービーズをナノスケールの量子ドットで機能化し、オールデジタル、全光学構成でのその場蛍光測定による光トラッピングとピンセットを実証した。 光トラップ環境の不活性化からサイズ、接着、凝集の制御まで、これを促進するために必要な化学について概説します。 ベクトル構造の光を利用する新しいホログラフィック光トラッピングのセットアップを導入し、均一な照明と調整された強度勾配ランドスケープのための伝播不変フラットトップビームなど、純粋なスカラーから純粋なベクトルまで調整可能な光の形式の配信を可能にします。 最後に、これが非線形効果ではなく線形 (空間モード) 効果によって単一波長トラップ内の漂白を抑制し、化学の光学分野の初期の分野を前進させる可能性があることを示します。

光トラッピングまたはピンセットは、しっかりと集光された光からの運動量伝達によるナノからマイクロサイズの粒子の操作を表します。 光ピンセットは、1970 年にアーサー アシュキンによってガウス ビームを使用して初めて実証され 1、半世紀経った今でもこのビームは光トラッピング実験の主流となっています 2。 しかし、光ピンセットに構造化光 3 を（光の強度、位相、偏光を変化させることにより）採用することで、粒子を捕捉するだけでなく、移動、回転、誘導することが可能になりました。 これらの構造化光トラップは今日では十分に確立された技術であり 4,5、ほとんどの構造化ビームはホログラムによって作成されるため、ホログラフィック光ピンセット (HOT) と呼ばれています 6,7。

HOT を使用すると、トラップの配列を作成して複数の粒子を同時に捕捉しながら、この配列パターンを動的に変更できるため、粒子の高度に制御された操作が可能になります8、9、10、11。 捕捉された粒子によって歪んだ後に再構成する構造化ビーム（ベッセルビーム）は、複数の平面での捕捉を可能にしました12。一方、遠視野ベッセルビームは、混雑した環境での捕捉を支援する光学シールドとして使用できます13。 構造化光ビームはトラップ強度を高めるだけでなく 14、例えばエアリービームは粒子を特定の軌道に沿って誘導することができ、サンプル中の粒子の選択的除去を可能にします 15、16。 花びらビームを使用すると、異なる屈折率を持つ粒子を同時にトラップすることが可能であり 17、凍結波はトラップの安定性と 3D 制御を向上させることができます 18。 光が線形運動量を運ぶという事実はよく知られており、光が粒子を捕捉できる理由ですが、光はラゲール ガウス (LG) ビームのように軌道角運動量 (OAM) も運ぶことができます。 これらの OAM 搬送ビームを使用することにより、光ピンセットは粒子の回転制御も行います 19、20、21、22。

これまでの HOT の研究は主に、振幅と位相が変調された構造ビーム (スカラー ビームと呼ばれます) に焦点を当ててきました。 一方、ベクトルビームは偏光も構造化されており、空間的に変化する偏光パターンを持っています。 ベクトルビームによるトラッピングは、光ピンセットで研究された構造化光の最新の手段であり、トラッピングコミュニティにとって有益であることがすでに証明されています4、5、23。 たとえば、放射状に偏光したベクトルビームは、しっかりと焦点を合わせたときに最小のスポットサイズを達成できることで有名であり 24,25、この特性は、より強力な軸方向光トラップを作成するために使用されています 26,27。 最初のベクトル HOT は Bhebhe らによって実証されました 28。これにより、ベクトルおよび/またはスカラー ビームの動的アレイによる光トラッピングが可能になりました。

光ピンセットで構造化光を使用することで、光ピンセットは強力な技術となり、さらに、このツールを蛍光分光法と組み合わせることで、粒子に力を加えるだけでなく、トラップ内の分子の化学的および構造的変化を観察することも可能になりました。 このため、単一分子蛍光と組み合わせた光ピンセットは、今日の生物学研究において非常に貴重で先駆的なツールとなっています 29,30,31。 しかし、トラップ光の強度は蛍光実験で使用される励起光の強度よりも最大 6 桁も高いため、蛍光顕微鏡を光ピンセットに統合することは簡単ではありません 32。 高強度のトラップ光により、蛍光色素の光退色が起こり、これは蛍光色素が非蛍光性になる不可逆的なプロセスです 33。 完全には理解されていませんが、光退色は通常、すでに励起された電子が光子を吸収し続けるときに発生し、その結果生じる解離が蛍光シグナルの永久的な損失につながります34。 光ピンセットの光退色を最小限に抑える最も一般的な解決策は、2 つの異なる光源を使用することです。1 つはトラップ用の非共振高強度レーザー、もう 1 つは励起用の共鳴低強度光源です。 これら 2 つのソースは、空間 36、37、38 または時間 39、40 のいずれかで分離されます。 光ピンセットに蛍光分光法を統合するのを支援するために構造化光を使用する可能性を調査した研究はほとんどなく、これまで構造化光のベクトルの性質を利用した研究はなく、グループは光退色を軽減するために渦または「ドーナツ」トラップビームを使用することを研究しただけです41。 42、43。 最近、Zhang と Milstein は、トラップ中心から 1 \(\upmu \text{m}\) 下の位置にある有機色素の光退色寿命が、別々のトラップ源と励起源を使用しながら、渦ビームでトラップすることによって延長できることを示しました。

ここでは、蛍光粒子を制御するためのベクトル光を使用した光トラッピングとピンセットを示します。 この研究で使用される蛍光粒子は、量子ドット (QD) として知られる半導体ナノ結晶です。 まず、QD 合成からトラップ用のマイクロサイズのポリマービーズへの結合まで、QD プローブを作成するための化学について詳細に説明します。 ナノスケールの量子ドットを備えた当社の機能化マイクロスケールポリマービーズは、ベクトル構造の光を利用する新しいホログラフィック光トラッピングセットアップに導入され、トラップ内の勾配力と強度プロファイルを調整する際に前例のない制御が可能になります。 これを、純粋なスカラーから純粋なベクトルまでの調整可能な形式の光の配信によって実証します。 私たちのセットアップとアプローチの力を示す例として、伝播不変ベクトルのフラットトップ ビームを作成し、非線形効果ではなく線形 (空間モード) 効果によって単一波長トラップ内の光退色を低減する可能性を示します。化学のための構造化光の探索において刺激的な見通しが得られます。

CdSe/ZnS コア/シェル QD は、ホットインジェクションコロイド合成法とそれに続く配位子交換反応を使用して調製され、L-システインで表面を官能化しました。 続いて行われる合成プロセスの概略図を図 1a に示します (詳細については「材料と方法」を参照)。 図 1b の疎水性 QD の TEM 画像とそのサイズ分布は、QD の平均直径が 5.2 ± 0.6 nm であることを示しています。 光ピンセットセットアップで捕捉できる蛍光プローブを作成するために、図1cに示すように、これらのQDをマイクロサイズのポリマービーズに結合しました。 よく知られ広く使用されている EDC/NHS 化学を使用して、量子ドットをビーズの表面に結合しました。 市販のポリスチレンビーズの表面に存在するカルボキシル基は、QD 上の L-システインリガンドの第一級アミン基と反応して、ビーズと QD の間に共有結合を形成しました。 コーティングされていない市販のポリマービーズとQDタグ付きビーズの表面のTEM画像を図1dに比較します。 コーティングされていないポリマービーズの表面は滑らかでしたが、QDタグ付きビーズの表面はQDコーティングにより粗いまたは「毛羽立った」外観を有しており、カップリング反応の成功が確認されました。 合成中のさまざまな時間におけるQDの正規化された蛍光強度を図1eに示します。 CdSe コアおよび CdSe/ZnS コア/シェル QD の成長時間が長いと、粒子が大きくなり (バンドギャップが小さくなり)、そのため蛍光発光波長のレッド シフトが観察されました。 配位子交換反応により、発光波長の赤方偏移も引き起こされました。 ただし、カップリング反応後、わずかなブルーシフトが観察されました。 光ピンセット設定で QD タグ付きビーズの蛍光発光を検出するには、蛍光光が 582 ～ 825 nm の波長の光を透過するダイクロイック ミラーを通過する必要がありました。 発光ピークの大部分が 582 nm より長くなるように、QD は最大蛍光ピークが 595 nm 以上になるように成長しました。

QDおよびQDタグ付きビーズの合成手順と顕著な特徴付け。 (a) L-システインでキャップされた CdSe/ZnS QD 合成ステップ。 (b) CdSe/ZnS QD の TEM 画像と対応するサイズ分布。 平均直径は5.2±0.6nmでした。 (c) EDC/NHS 化学を介した、L-システインでキャップされた QD のマイクロサイズのビーズの表面へのカップリング反応。 (d) コーティングされていないポリマー (左) と QD タグ付きビーズ (右) の表面の TEM 画像。カップリング反応の成功を確認します。 (e) 合成中のさまざまな時点での QD の蛍光発光。

QDタグ付きビーズを調製する際の合成ステップの一部を最適化することの重要性が図2で強調されています。まず、L-システインでキャップされたQDの精製は時間がかかる可能性がありますが、単分散ビーズを得るには重要なステップです。不純物のない QD サンプルが得られ、その結果、ポリマービーズ上に均一な QD コーティングが得られます。 図2aでは、精製されたL-システインでキャップされたQDの外観が左側に示されており、ここでは個々のQDが見えますが、精製前の粗製L-システインでキャップされたCdSe / ZnS QDのTEM画像が右側に示されています。 粗サンプルは QD 間に多くの不純物とともに凝集しているため、個々の QD は確認できません。 QD の表面積が大きいため、有機不純物が付着するスペースが多くなり、厳密な精製が必要になります。

QDタグ付きビーズを調製する際の最適化ステップ。 (a) L-システインでキャップされた CdSe/ZnS QD の精製 (左) および粗製 (右) の TEM 画像。 (b) L-システインでキャップされた CdSe/ZnS QD の 5 日間にわたる蛍光強度の回復。 挿入写真は、特定の日の UV 光下でのサンプルの外観を示しています。 (c) 左側の TEM 画像は、QD で均一にコーティングされた QD タグ付きビーズを示していますが、挿入図 1 ～ 3 は、一部の合成ステップが最適に実行されなかった場合の QD タグ付きビーズを示しています。 挿入図 1 では、QD を添加する前に過剰な EDC を除去しませんでした。挿入図 2 は、超音波処理ではなく磁気撹拌によって行われた反応を示し、挿入図 3 は、アセトンの存在によるポリマービーズの変形を示しています。

L-システインでキャップされたCdSe/ZnS QDの精製と乾燥後、それらの蛍光強度は消光されました。 しかし、しばらくして、図2bに示すように、水に再分散すると蛍光強度が回復しました。 この図は、5 日間にわたる蛍光の回復を示しています。 最初の測定は、精製された QD が水に再分散された直後に行われました。 この消光現象は、Noh et al.44 によって発表された研究によって説明できます。 この研究で、彼らは、水溶性CdSe QDが凝集体を形成すると、その蛍光が消光することを示した。 同様に、L-システインでキャップされた量子ドットは水素結合を示し、凝集する傾向があることがわかっています。 したがって、L-システイン量子ドットは、濃縮されると凝集体を形成し、蛍光消光を引き起こす可能性があります。 それらを水に再分散すると、凝集体は分散し、蛍光発光が回復しました。 QD からの蛍光シグナルが確実に回復され、安定していることを確認するために、カップリング反応を実行する前に QD を脱イオン水中に数日間保管しました。

図2bの左側には、均一なQDコーティングを施したQDタグ付きビーズのTEM画像が示されていますが、挿入図1〜3は、一部の合成ステップが最適に実行されなかった場合のQDタグ付きビーズを示しています。 挿入図 1 は、QD を追加する前に過剰な EDC が完全に除去されなかった場合の QD タグ付きビーズを示しています。 未反応の EDC はビーズ上のカルボキシル基だけでなく、QD 上の L-システインのカルボキシル基も活性化しました。 これらの活性化された量子ドットは互いに反応して大きな凝集体を形成します。 挿入図 2 は、マグネティックスターラーを使用してカップリング反応を行ったときの不均一な QD コーティングを示しています。 このビーズの表面上の QD の量は、片側ではほとんど何もないところから、もう一方の側では大きな塊までさまざまでしたが、超音波槽内で反応を実行すると、QD コーティングの均一性が大幅に向上しました (左に示すように)。 。 最後に、合成を試みる前に、研究中のシステムを注意深く研究することの重要性を指摘したいと思います。 アセトンは QD の精製に優れた溶媒であることが判明しましたが、QD ビーズ システムでは、挿入図 3 に示すように、この溶媒によりポリマー ビーズが変形してしまいました。 したがって、QDタグ付きビーズの精製には蒸留水のみが使用されました。

(a) 平坦化ガウス ビーム アプローチを使用してシミュレートされたスカラー フラットトップ ビームの伝播。 (b) 不変のフラットトップ プロファイルを示すベクトル フラットトップ ビームの伝播。 このビームの伝播の不変性をよりよく視覚化するために、ピーク強度が正規化されました。 (c) \(\alpha\) の変化としての強度プロファイルは、渦からフラットトップ、ガウスビームへの進化を示しています。 臨界値 \(\alpha\) におけるベクトル ビームのプロファイルが下のパネルに示されており、渦ビームは \(\alpha =0\)、ベクトル フラットトップ ビームは \(\alpha =0.5\) にあります。 \(\alpha =1\) のガウス ビームです。

ここでは、ベクトル フラットトップ ビームに焦点を当ててベクトル HOT を示します。 このビームは、均一な励起照明を提供し、伝播不変ビームであり、急峻な強度勾配を持ち（つまり、強力な光トラップを生成できる）、光退色を軽減するためにピーク強度が低いため、蛍光粒子の光トラップに有益です。

理想的なフラットトップビームは均一な強度プロファイルを持ち、エッジではゼロになります。 ただし、実験室では、フラットトップビームの近似値しか作成できません。 いくつかの近似には、スーパー ガウス ビーム、平坦化ガウス ビーム、およびフェルミ ディラック ビームが含まれます 45、46。 これらすべての近似の主な欠点は、強度プロファイルが伝播するにつれて変化することです。フラットトップの強度プロファイルは特定の平面でのみ得られ、その後、図3aに示すようにプロファイルが大幅に変化します。 プロファイルの素早い変化により、しっかりと焦点を合わせた捕捉面でフラットトップ プロファイルを光学的に伝達することが非常に困難になります。 対物レンズを通してサンプル上に単純に焦点を合わせ、そのプロファイルを維持できるビームは、より理想的です。これはベクトル フラットトップ ビームによって実現されます。 ベクトル フラットトップ ビームは、自由空間の 2 つの固有モードの重ね合わせによって作成されるため、伝播不変です。 ベクトルフラットトップビームの伝播を図3bに示します。

ベクトル フラットトップ ビームは、ガウス ビームと渦ビームの（ベクトル）加算によって得られます47。 したがって、フィールドは次のように与えられます。

ここで、 \(\hbox {LG}^l_{p}\) はラゲール ガウス (LG) モードを指し、p は動径インデックス、l は方位角インデックスを表します。 したがって、\(\hbox {LG}_0^0\) はガウス ビーム、\(\hbox {LG}_0^1\) は渦ビームです。 ベクトル ビームは、均一な偏光を持つ直交スカラー フィールドを追加することによって形成されます。ここで、ガウス ビームは水平偏光を持ちます \({\hat{{\textbf {e}}}_{{\textbf {H}}}}\)渦ビームの垂直偏光 \({\hat{{\textbf {e}}}_{{\textbf {V}}}}\)。 式では、 (1) では、2 つのスカラー ビームを重み付けるために係数 \(\alpha\) が導入されました。これは、\(\alpha =0\) の場合の渦から \(\alpha =1\) の場合のガウス ビームまでのあらゆる場を意味します。生成される。 \(\alpha =0.5\) の等しい重み付けでベクトル フラットトップを使用します。 \(\alpha\) の変化に伴うベクトルビームの変化を、臨界 \(\alpha\) 値 (\(\alpha = 0, 0.5\) および 1) でのビームプロファイルとともに図 3c に示します。 \(LG_p^l\) フィールドはよく知られた形式になります48

ここで、 \(L_p^{|l|}\) は関連するラゲール多項式、 w(z) \(=w_0\sqrt{1 + \left( \frac{z}{z_R}\right) ^2}\) です。 、 \(w_0\) はガウス ビーム半径、 \(z_R=\frac{\pi w_0^2}{\lambda }\) はレイリー範囲、 \(R(z)=z\left( 1 + \ left( \frac{z_R}{z}\right) ^2\right)\) は曲率半径で、\(\psi (z)=\text {arctan}\left( \frac{z}{z_R} \右)\) はグイフェーズです。

ここでは、ベクトル フラットトップ ビームとガウス ビームを (理論的に) 比較して、フラットトップ ビームがガウス ビームよりも優れている点 (またはその逆) を判断します。 ベクトル ビームの強度は、通常、ガウス ビームと渦ビームの強度の合計として記述できます (偏光要件がいくつかあります)。

ここで、ベクトル フラットトップ強度は \(\alpha =0.5\) を設定することで得られ、ガウス強度は \(\alpha =1\) を設定することで得られます。

ビームの勾配力 (またはトラップ強度) は、ビームの強度勾配 \(F_{grad}=c\nabla I\)49,50,51 に比例します。 ベクトル フラットトップとガウス ビームの相対的な力のみが重要であるため、\(c=1\) は次のように仮定できます。

したがって、ビームの強度プロファイルがわかっていれば、その勾配力は簡単に計算できます。

ベクトルフラットトップビームが蛍光粒子の捕捉に役立つためには、ガウスビームと同様の捕捉強度を持たなければなりませんが、光退色を軽減できる可能性があるためにピーク強度が低くなければなりません。 これが真であるかどうかをテストするために、ビーム領域全体にわたる平均勾配力 (\({\bar{F}}_{grad}\)) A が考慮されました。

より関連性があるのは、フラットトップ (FT) ビームとガウス (G) ビームの平均勾配力の比です。

したがって、 \(\gamma = 1\) ではフラットトップ ビームとガウス ビームの平均勾配力は等しく、 \(\gamma > 1\) ではベクトル フラットトップのトラップ強度がより強くなります。

比率\(\gamma\)は、ガウスビームとベクトルフラットトップビームの異なる相対パワーで計算され、図4aにプロットされました。 したがって、この図は、出力を調整するときに 2 つのビームの相対勾配力がどのように変化するかを示しています。 3 つの特殊なケースが、図 4b に示す対応する強度プロファイルとともにグラフに示されています。それは、(1) 同じパワー、(2) 同じ勾配力、および (3)フラットトップと同じピーク強度がプロットされます。 まず、2 つのビームのパワーが等しい \(\gamma =0.75\) の場合、これはガウス ビームがより強力なトラップであることを意味します (青い線)。 ベクトル フラットトップの強度勾配がより急峻であるにもかかわらず、ガウス ビームの高強度ピークがこの効果を打ち消すため、これは予想されることです。 次に、2 つのビームが同じ平均勾配力 (\(\gamma =1\)) を持つためには、ガウス ビームのパワーがベクトル フラットトップ ビーム (緑の線) の 75% でなければなりません。 最後に、2 つのビームのピーク強度が同じ場合、つまりガウスのパワーがフラットトップ ビームの半分の場合、フラットトップ ビーム トラップはガウス ビーム トラップ (オレンジ色の線) よりも 1.5​​ 倍強くなります。 。 最も関係があるのは、2 つのビームが同じ勾配力を持つ場合です。 ここで、ベクトル フラットトップ ビームとガウス ビームが同じトラップ強度 (または勾配力) を持っている場合、ベクトル フラットトップのピーク強度はガウス ビームよりも低いことが明らかです。 これは、ベクトル フラットトップ ビームを使用すると、ガウス ビームよりも低いピーク強度で同じ強度で粒子を捕捉できることを意味します。

ガウス ビームとベクトル フラットトップ ビームの勾配力の比較。 (a) 相対勾配力とガウスおよびベクトルのフラットトップ ビームのパワーとの関係。 (b) ベクトル フラットトップ ビームと同じパワー、勾配力、強度を有するガウス ビームに対応する強度プロファイル。

ベクトルホログラフィック光ピンセットの実験セットアップの図。 挿入図は、実験的に生成された渦ビームとガウス ビームを組み合わせてベクトル フラットトップ ビームを形成したものを示しています。 異なる伝播角度を持つガウス ビームと渦ビームを生成するために SLM 上でエンコードされた多重化ホログラムが上のパネルに示されています。 下のパネルは、近距離場と遠距離場で実験的に生成されたフラットトップ ビームの断面を示しています。 理論上の断面は緑色で示され、実験データ点は黒色で示されています。

ベクトルホログラフィック光トラップの実験設定を図5に示します。波長\(\lambda\) = 532 nmの拡大され平行化されたガウスビームを使用して、反射型空間光変調器（SLM、ホロアイ冥王星、ドイツ）。 ベクトル フラットトップ ビームを作成するために、異なる伝播角度を持つガウス ビーム (\(\hbox {LG}^0_0\)) と渦ビーム (\(\hbox {LG}^1_0\)) が SLM で作成されました。 (挿入図は実験的に得られたビームの 2D 強度​​プロファイルを示しています)。 複素振幅変調を使用して SLM 上でエンコードされた多重化グレースケール ホログラムが上のパネルに示されており、2 つのビームの異なる回折格子が挿入図として示されています。 ガウス ビームと渦ビームは、ビームを偏光ビーム スプリッター (PBS) に導き、そこで干渉計によって結合されるように、D 型ミラー (DM) を使用して分離されました。 不要な 0 次およびそれ以上の次数は、PBS の前に空間フィルタリングによって除去されました。 1 つのビームの経路に 1/2 波長板 (HWP) が追加され、その偏光が水平から垂直に変化し、直交偏光ビームの重ね合わせが可能になりました。 したがって、ベクトル フラットトップ ビームは PBS 後に得られました。 下のパネルは、近距離場と遠距離場で実験的に得られたフラットトップビームの断面を示しています。

ダイクロイック ミラー (DM) からの光の反射は、水平偏光と垂直偏光でわずかに異なります。 DM がベクトル ビームのプロファイルを変更しないことを保証するために (直交偏光によってパフォーマンスがわずかに変化することを考慮して)、\(45^{\circ }\) に 1/4 波長板 (QWP) が追加されました。ベクトル ビームの経路を変更して各ビームの偏光を円形に変更します。これは、ベクトル光を作る 2 つのビームが同じ「量」の垂直偏光と水平偏光を持つことを意味し、DM は両方に同じ効果をもたらします (ビーム プロファイルQWPなしの場合とQWPなしの場合を補足図S1に示します。 生成されたビームが対物レンズの後部開口に確実に到達するように、4f システム (レンズ L1 および L2) が組み込まれています。 高 NA 対物レンズ O はビームを集束させ、サンプル面内に光トラップを作成します。

サンプルは、カバー スリップと顕微鏡スライドの間にサポートされた 2 \(\upmu \text{m}\) ポリスチレン ビーズ (トラップの剛性を取得するために使用されるサンプル) または QD タグ付きポリスチレン ビーズ (蛍光サンプル) のいずれかで構成されていました。 未処理のガラス製品にはシラノール基 (Si-OH) が含まれており、これがガラスの表面を親水性にし、水素結合によって極性化合物が表面に吸着します。 この研究では、ポリスチレンビーズとQDタグ付きビーズの表面に極性基が含まれていました。 したがって、これらの基により、ビーズは未処理のガラスの表面に固定化され、粒子を捕捉しようとするときに問題が発生しました。 これを解決するために、サンプルを組み立てる前にガラス製品 (顕微鏡スライドとカバースリップ) を非活性化しました。 ガラス製品を不活性化すると疎水性が高まり、極性化合物の望ましくない吸着が防止されました。 不活性化は、ガラス製品をジメチルジクロロシラン (DMDCS) と反応させることによって達成されました。

倒立顕微鏡のセットアップは、蛍光と照明光を通過させながらレーザー光を対物レンズに反射する DM を使用して実装されました。 同じレーザーをトラップと励起の両方に使用しました。 サンプルからのトラッピングと蛍光発光を同時に観察するために、ノッチ DM によって透過され、ロングパス DM によって反射され、CCD カメラに画像化される青色光をサンプルに照射するために使用されるように、イメージング/検出システムをセットアップしました。 。 サンプルからの蛍光発光 (赤色ビーム) は両方の DM によって送信され、アバランシェ フォト ダイオード (APD、単一光子検出器) によって検出されました。 この高感度光子検出器は、単一の QD タグ付きビーズから発せられる蛍光を検出するために必要でした。 DM は 100% 効果的ではないため、トラップ レーザーからの光がカメラや APD に到達しないようにするために、追加のカラー フィルターが挿入されました。

この研究はベクトル フラットトップ ビームの作成に焦点を当てていますが、このセットアップを使用して、異なるスカラー ビームを単に重ね合わせるだけで任意のベクトル ビームを生成できます。 たとえば、2 つの渦モード \(\hbox {LG}_0^1\) と \(\hbox {LG}_0^{-1}\) を追加すると、半径方向および方位角方向に偏光した渦ビームが作成されます。

自由粒子とベクトルフラットトップビームで捕捉された粒子の動きを5分間監視しました。 これらの粒子のY方向の位置の軌跡と分布を図6aに示します。 粒子の位置は CCD カメラを使用して追跡され、すべての画像解析は Matlab で行われました。 この図から、自由粒子がランダムなブラウン運動を受け、5 分間で 7.33 \(\upmu \text{m}\) (Y 方向に) 移動したことが明らかです。 ただし、捕捉された粒子は解析時間中にわずか 0.44 \(\upmu \text{m}\) の移動に限定されており、ベクトル フラットトップ ビームによる光捕捉が成功したことが証明されています。

トラップ内の粒子のわずかな動きは、粒子をトラップから押し出す熱雑音と、粒子を引き戻す光学力によるものです。この動きを監視することで、トラップの強度を等分配法を使用してトラップの強度を決定できます。捕捉された粒子の位置の分散52（詳細は補足情報に記載）。 トラップされたビーズの動きを 5 分間追跡し、毎秒位置を測定しました。 各パワー測定（対物レンズの後に測定）ごとに 5 つのビーズがトラップされ、トラップの剛性が決定されました。 各出力での平均トラップ剛性が図 6b にプロットされており、誤差バーは標準誤差です。 このグラフから、レーザー出力とトラップ剛性の間の線形関係が明らかです。 挿入図は、30 \(\mu \hbox {W}\)、120 \(\upmu \text {W}\)、300 \(\mu \hbox {W}\ の累乗で捕捉された粒子の軌道を示しています。 ）。

ベクトル フラットトップ ビームで 2 \(\upmu \text{m}\) の粒子を光学的にトラップします。 (a) 5 分間監視した、自由粒子とベクトル フラットトップ ビームで捕捉された粒子の軌道と確率密度 (y 方向)。 自由粒子はブラウン運動を示し、7.33 \(\upmu \text{m}\) を超えて移動しますが、トラップされた粒子の移動はわずか 0.44 \(\upmu \text{m}\) に制限されます。 (b) さまざまなレーザー出力でのベクトル フラットトップ トラップの剛性 (x 方向)。 挿入図は、30 \(\upmu \text {W}\)、120 \(\upmu \text {W}\)、300 \(\upmu \text {W}\ の累乗で捕捉された粒子の軌道を示しています。 ）、 それぞれ。

図 7 では、トラップ ビームを純粋なスカラー ガウス ビームと渦ビームからそれらのベクトルの組み合わせに変更することによって、ベクトル HOT の調整可能性が実証されています。 ここでは、さまざまなビーム サイズでのトラッピングの効果も示します。 一番上の行には、トラップビームの理論的プロファイル（色でプロット）が示されており、実験データ（黒で表示）とよく一致しています。

粒子が受ける光捕捉力（集束ビームによる）は、粒子に対するビームのサイズに依存します。 前に示した理論では、ビームの平均勾配力は、ビームの全面積にわたって積分することによって決定されました。 ただし、粒子がこの合計の力を受けるのは、粒子がビーム全体を遮断した場合のみです。 これは、トラップのビームが粒子サイズより小さい場合に当てはまります。 これは、図 7 の中央の行にあるトラップされたビーズの場合であり、ここでは 2 \(\upmu \text{m}\) のビーズが 1.8 \(\upmu \text{m}\) のビーム直径でトラップされています。 。 下の行は、ビームがビーズよりも大きい (3.1 \(\upmu \text{m}\)) 場合の光トラップ内のビーズの動きを示しています。 ビーム サイズは、サンプル スライドからのビームの後方反射を画像化することによって決定されました。 前述したように、ダイクロイック ミラーは 100% 効率的ではないため、トラップ ビームの一部が透過され、CCD カメラに画像化されます。 カメラは、サンプル内の 2 \(\upmu \text {m}\) ビーズの既知の直径を使用して校正されました。 小さなトラップの場合、ビードの動きはすべてのビームの中心に集中し、フラットトップ ビームではもう少し多くの動きがあり、ボルテックス ビームではさらに多くの動きがありました。 調和振動が想定され、これらのトラップのトラップ剛性 (等分配法で計算) が報告されます。 大きなガウス トラップのビーズの動きも中心にありましたが、小さなガウス トラップよりも硬くありませんでした。 大きな渦ビームに捕捉された粒子の中心は、強度勾配とその結果として捕捉力が存在する場所であるため、ビームのリング内に留まり、ビームのリングに沿った動きは主にブラウン運動によるものでした。 最後に、大きなフラットトップ トラップ内のビーズの動きは、均一なビーム プロファイル (ビームの端には勾配力のみが存在する) に対応して、より均一になりました。 これらのプロットから、ビームのサイズと種類が光トラップの強度と特性に大きな影響を与えることは明らかです。

ビーム サイズが粒子より小さい場合 (小ビーム トラップ)、または粒子より大きい場合 (大ビーム トラップ) の場合の、ガウス、ボルテックス、ベクトル フラットトップ ビームでトラップされたビーズの動き。 ビーズの直径は 2 \(\upmu \text {m}\)、小さなトラップのビーム直径は 1.8 \(\upmu \text{m}\)、大きなトラップの直径は 3.1 \(\upmu \text{m}\)。 小型ビームトラップのトラップ剛性 (±標準偏差) が報告されます (単位: pN/\(\upmu \text{m}\))。

捕捉力 60 \(\upmu \text {W}\) のガウス ビーム トラップおよびフラットトップ ビーム トラップに捕捉された 3 つの QD タグ付きビーズの平均光退色 (影付きの領域は標準誤差を表します)。 ガウス ビーム トラップと比較して、フラットトップ ビーム トラップの蛍光色素分子では、より長い光退色寿命が観察されました。 挿入図は、トラップビームの実験プロファイルを示しています。

ベクトル フラットトップ ビームは、ガウス ビームと同じ勾配力を持つように生成できますが、ピーク強度は 25% 減少します (図 4 を参照)。 フラットトップビームのこの特性を利用して、光トラップにおける光退色を軽減することができます。 さらに、フラットトップビームがガウスビームと同じパワーで生成された場合、特に低いトラップパワーでの勾配力（トラップ強度）の損失は最小限であり、ピーク強度は50％減少します（補足図に実験的に示されているように） .S3)。 図 8 は、単一波長トラップ内で 60 \(\mu \hbox {W}\) のパワーでガウス ビームまたはフラットトップ ビームでトラップされた 3 つの QD タグ付きビーズの平均蛍光発光を示しています（標準トラップを使用）エラーは影付きの領域で表されます)。 蛍光シグナルは正規化され、バックグラウンドが差し引かれました（補足図S4の詳細）。 どちらのトラップでも、粒子の蛍光はトラップに入ると減少しました。 各粒子の光退色半減期 (\(\tau\)) は、指数関数 \(f(t) = A\hbox {exp}(-t/\tau )+C\) を蛍光に当てはめることによって決定されました。信号（近似関数と \(R^2\) の値については補足図 S5 を参照）。 ガウス トラップにおける QD タグ付きビーズの平均光退色半減期 (±標準偏差) は 14 ± 3 秒、ベクター フラットトップ トラップにおける半減期は 20 ± 3 秒と決定されました。光退色半減期の%増加。

バイオフォトニクスおよび物理学における光トラッピングとピンセットの応用は非常に確立されていますが、化学での使用ははるかに開発されていません。 ここでは、例としてカスタムメイドの QD を使用して、新しいホログラフィック トラップ内の光ベースの化学を強化する際の光の完全なベクトルの性質を紹介します。 我々は、QD ビーズベースの蛍光アッセイと光ピンセットの組み合わせが、前立腺特異抗原、H5N1 および H7N9 鳥インフルエンザウイルス遺伝子などの分析物の検出に、高い感度と 1.0 という低い検出限界で使用されていることを指摘します。 2.0午後53、54、55。 したがって、この研究で合成された QD プローブは、感度を高めて検体 (環境汚染物質 56、57、58 など) を検出するための光ピンセット セットアップ内のセンサーとして機能する可能性があり、刺激的な将来展望です。

結論として、ベクトル光を使用して QD 蛍光プローブを捕捉および制御する光ピンセットのセットアップを実証しました。 我々は、マイクロサイズのポリマー球を量子ドットで機能化するために関与する化学を概説し、サイズ、接着、凝集制御の重要性を強調しました。 ベクトル HOT の多用途性は、スカラー ビームとベクトル ビームを切り替え、異なるビーム サイズで粒子を捕捉することによって実証されました。 伝播不変ベクトルのフラットトップビームでトラップすることにより、強度勾配ランドスケープを調整するだけで単一波長光トラップで光退色を低減できる可能性を実証しました。

酸化カドミウム（CdO）、オクタデカ-1-エン（ODE）、オレイン酸（OA）、トリオクチルホスフィンオキシド（TOPO）、セレン（Se）、酸化亜鉛（ZnO）、硫黄（S）、L-システイン、N-( 3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩 (EDC)、N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)、メタノールおよびアセトンは、Sigma Aldrich (USA) から購入しました。 クロロホルム、エタノール、および水酸化カリウム (KOH) は、Associated Chemical Enterprises (南アフリカ) から購入しました。 Afrox (南アフリカ) のアルゴン ガス ベースライン 5.0 を使用しました。 合成中に使用した脱イオン水は、社内の Drawell Eco-Q 脱イオン水システム (中国) からのものでした。 \(\hbox {Invitrogen}^{\text {TM}}\) 2 \(\mu\)m カルボキシル官能化ラテックスビーズは Thermo Fisher Scientific (南アフリカ) から購入しました。

まず、セレン(0.30 g Se、1.94 g TOPOおよび25 ml ODE)、亜鉛(0.21 g ZnO、10 ml OAおよび15 ml ODE)および硫黄(0.087 g S、10 ml OAおよび15 ml ODE)前駆体溶液を調製した。 。 これらの溶液を 40 \(^{\circ }\hbox {C}\) で 5 時間撹拌して、確実に完全に混合しました。 ＱＤ合成装置には、コンデンサー、温度計、加熱マントル上に配置されたアルゴンガス入口を備えた三口丸底フラスコが含まれていた。 全反応はアルゴン条件下で行われた。 １．３ｇのＣｄＯ、５０ｍｌのＯＤＥおよび３０ｍｌのＯＡをフラスコに加え、Ｃｄ−ＯＡ複合体の形成を示す無色の溶液が形成されるまで、２６０℃で激しく撹拌した。 Se 前駆体をフラスコ (25 ml) に加え、\(\sim 240\) \(^{\circ }\hbox {C}\) の温度で 15 分間核形成とコアの成長を進行させました。 。 コアの周りのエピタキシャルＺｎＳシェル成長は、１０ｍｌのＺｎ前駆体を添加し、その後迅速に１０ｍｌのＳ前駆体をコア溶液に添加することによって開始された。 殻の成長は、240 \(^{\circ }\hbox {C}\) の温度で 40 分間放置されました。 40分後、反応物を室温まで冷却した。 QD を遠心分離によりメタノールで精製し、OA および TOPO でキャップされた疎水性 CdSe/ZnS QD を得ました。

次に、配位子交換反応を実行して、CdSe/ZnS QD の表面を L-システインで官能化して親水性にしました。 ４．４ｇのＫＯＨ、６０ｍｌのＭｅＯＨおよび３ｇのＬ－システインの溶液を調製し、すべてのＬ－システインが確実に溶解するように超音波浴に１０分間入れた。 疎水性CdSe/ZnS QD溶液をクロロホルムに懸濁し、L-システイン溶液に加えた。 室温で撹拌しながら脱イオン水をゆっくりと混合物に添加すると、透明なオレンジ色の溶液が乳白色に変化した。 １時間撹拌した後、溶液を一晩放置して有機相と水相を完全に分離した。 現在水相にある L-システインでキャップされた QD を、エタノール (\(\× 4\)) およびアセトン (\(\× 2\)) を用いた遠心分離によって精製しました。 凝集物のない単分散の QD 溶液を達成するには、QD の表面から過剰な有機化合物を除去するために厳密な精製が必要でした。 QD 製品の吸光度および FTIR スペクトルをそれぞれ補足図 S6 および S7 に示します。

L-システインでキャップされたQDをマイクロサイズのポリマービーズに結合させるために、2.5 mlのEDC（0.1 M）と2.5 mlのNHS（0.1 M）を50 \(\mu \hbox {l}\)のポリマーに加えました。ビーズ（１ｍｌの水で希釈）を加え、氷浴中で３０分間撹拌して、ビーズ上のカルボン酸基を活性化した。 過剰のＥＤＣを脱イオン水による遠心分離により除去した。 遠心分離後、活性化ビーズを4 mlの水に再分配し、3 mgのQDを加えました。 カップリング反応を超音波浴内で 2 時間進行させて、ビーズ上の QD の均一なコーティングを確保しました。 結合生成物を水での遠心分離（\(\×3\)）によって精製し、冷蔵庫内の脱イオン水中で保存した。 QDタグ付きビーズのFTIRスペクトルを補足図S8に示します。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、画像解析と光学セットアップについて支援してくれた Valeria Rodríguez-Fajardo 博士と、初期の量子ドット合成について支援してくれた Sifiso A Nsibande 博士に感謝したいと思います。 この研究は、南アフリカ国立研究財団によって部分的に支援された研究に基づいています (助成番号: 122136)。

プレトリア大学化学科、プレトリア、南アフリカ

アネ・クリッツィンガー & パトリシア BC フォーブス

ウィットウォータースランド大学物理学部、ヨハネスブルグ、南アフリカ

アンドリュー・フォーブス

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AK が実験を実施し、AF と PBCF がプロジェクトを監督しました。 著者全員がデータの解釈を支援し、原稿をレビューしました。

パトリシアBCフォーブスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kritzinger, A.、Forbes, A. & Forbes、PBC ベクトル構造光による光トラッピングと蛍光制御。 Sci Rep 12、17690 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21224-1

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受信日: 2022 年 8 月 1 日

受理日: 2022 年 9 月 23 日

公開日: 2022 年 10 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21224-1

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