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Jan 18, 2024

電着磁性ナノ多孔質膜

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 1358 (2022) この記事を引用

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4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

超常磁性ナノビーズは、バイオアッセイにおけるナノキャリア (細胞外小胞、リポタンパク質、ウイルス) の免疫捕捉において、マイクロビーズに比べて、高収量捕捉、インキュベーション時間の短縮、およびより高い捕捉能力などのいくつかの利点を提供します。 しかし、ナノビーズの超常磁性の特徴には高いナノスケールの磁場勾配が必要であるため、ナノビーズを「プルダウン」するのは困難です。 ここでは、電着されたトラックエッチングされた膜が、ナノ細孔の周囲に複数のエッジを持つユニークな超常磁性ナノエッジリングを生成することが示されています。 均一な外部磁場により、このナノエッジ接合に誘導された単極子と双極子が結合して、10 倍高いナノビーズ捕捉力が生成されます。 高密度のナノビーズ懸濁液は、99% のビーズ捕捉率で高スループットで磁性ナノ多孔質膜 (MNM) を通して濾過できます。 ナノビーズ/MNM による不均一媒体中での特定のナノキャリアの収率は 80% を超えます。 再現性、低損失、濃度に依存しない捕捉率も実証されています。 したがって、この MNM 材料は、ナノビーズ免疫捕捉の生理学的サンプルへの応用を拡大します。

細胞外小胞（EV）とリポタンパク質は、さまざまな体液中に見られる生物学的ナノ粒子です1、2、3。 最近発見された分子カーゴを細胞間で輸送するというそれらの機能は、多くの分野でかなりの研究活動を触媒しています4,5。 これらの生物学的ナノキャリアは、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである可能性があります6,7。 したがって、特定の EV、リポタンパク質、およびそれらの分子カーゴも潜在的な疾患バイオマーカーとなります 8、9、10。 ただし、これらのバイオマーカーは病気の細胞に特有のものではなく、単に過剰発現しているだけであることがよくあります。 したがって、正確な定量化が必要となります。 それらのサイズと不均一性により、特定の EV およびリポタンパク質を高収率で単離することは依然として困難であり、バイオマーカーアッセイに大きな偏りをもたらす可能性があります 11、12、13、14、15。 EV とリポタンパク質は、多くのデバイスで分解、凝集、または吸着される傾向があります 16、17。 したがって、前処理/分離プロセスが長く複雑であるフローサイトメトリーやクロマトグラフィー分離よりも、即時かつ短時間の接触による分離が優先されます。 したがって、効果的で迅速かつ利用しやすい単離方法は、EV およびリポタンパク質を含むあらゆる臨床応用の前提条件となります。 高収量捕捉技術の進歩は、病原性ウイルスや細菌の検出など、多くの生物医学分野にわたって有益です。

最も特異的な EV およびリポタンパク質の単離方法は免疫捕捉です 18,19,20。ただし、免疫沈降 (IP) やイムノアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫捕捉技術には、プローブの飽和や分析物の損失による低収率の問題があります。 ナノキャリアが蛍光標識されている場合、磁性マイクロビーズによって捕捉されたナノキャリアをフローサイトメトリーによって選別および定量することができます。 ただし、標識と単離のプロセスには時間がかかり、最適な収量を達成するまでに 1 日以上かかる場合があり、その結果、ナノキャリアの大幅な損失が発生します。 輸送が制限されたドッキング反応ではマイクロビーズの移動度が低いため、そのスループットは長いインキュベーション時間 (8 ～ 48 時間) によっても制限されます。 収量とインキュベーション時間の問題の解決策は、ナノ磁気ビーズを使用することです。 体積あたりの表面積が大きいため、より多くの結合部位が得られます。 サイズが小さいため、拡散性が高く、インキュベーション時間は短くなります (約 30 分)。 ビーズは、不均一な生理学的サンプル中を拡散して、複雑化または凝集により移動度が低下した特定のナノ粒子ターゲットを捕捉することもできます。 体積あたりの表面積が大きいため、同じビーズ重量濃度の場合、マイクロビーズ/ナノビーズ半径の比 (約 100) に等しい係数でより多くの結合プローブが提供されます。 このプローブ数の増加により、特に抗体プローブの親和性が高い場合、すべての標的ナノキャリアが完全に枯渇する可能性があり、したがってナノキャリア結合収量が桁違いに高くなります。

しかし、その超常磁性の性質により、バルク免疫捕捉後にナノビーズおよびその捕捉されたナノキャリアを捕捉することは困難です。 超常磁性ビーズにかかる磁力は場の勾配の二乗（磁場と磁場勾配の積の２倍）に比例するのに対し、磁性マイクロビーズにかかる力は局所磁場に比例します。 一般的に使用される磁気マイクロビーズ トラップの場合、場の勾配はマイクロビーズの 1 半径未満に限定されるため、マイクロビーズの周囲の狭い領域内でのみナノビーズをトラップできます。 したがって、高収量の捕捉には、高密度に充填されたビーズの長いカラムが必要です。 たとえば、ナノビーズ捕捉用の市販のマイクロビーズ カラム (μColumn、Milyteni Biotec) は、ナノビーズの 20 ～ 30% しか捕捉しません 21。 収率が 90% を超えるには、繰り返し (4 回以上) トラッピングが必要です。 磁性フィルムは、その非集束 (非放射状) 形状により、磁性ビーズよりも長い磁界侵入長を生成できます。 最近、Issadore らは捕捉収率が向上した磁性層でコーティングされたナノ多孔質膜を開発しましたが、効率的なビーズ捕捉には依然として複数の膜層が必要です 22。 磁場は長距離ですが、磁場の勾配はコーナーを除いて平面磁性膜のものではありません。 マイクロチャネル 23 およびナノ細孔 24 における電場に関する以前の研究では、チャネルまたは細孔のくさび角 α が大きい場合、高勾配の特異な電場がチャネルまたは細孔のくさびコーナーの高誘電率 (水) 側で発生することを示しました。より高い誘電率の位相はπを超えます。 このウェッジ特異磁場は、−(π/α) − 1 のべき乗則スケーリングでウェッジの先端から放射状に減衰するため、高い磁場勾配も持ちます。 動径減衰指数は、球の -2 と無限に長い円柱の -3/2 の間に制限されます。 この特異なウェッジ モードはウェッジの周囲で非対称であり、高誘電率相に双極子を導入します。 近接場プラズモニクスには、よりよく知られた「避雷針」ウェッジ特異点が存在します 25、26、27。これはウェッジの周囲で対称であり、特異場は低誘電率側で発生します。 これは、高誘電率側のくさび角が π より小さい場合に発生します。 これにより、ウェッジの低誘電率側にモノポールが導入されます。 ここでは、この概念を磁場に拡張して、高スループットでの超常磁性ビーズの高収量捕捉を達成します。 我々は、異種接合を備えたマルチエッジ超常磁性 NiFe ナノエッジを設計しました。そのエッジは、ナノ多孔質高分子膜の各ナノ細孔の周囲に磁気単極子と双極子の両方を維持します。 このアプローチにより、単一の磁性ナノ多孔質膜 (MNM) のスループット 5 mL/h で 1 つの膜の捕捉収率が 99% に大幅に増加します。

スパッタリング中に形成される滑らかな細孔エッジと比較して、電気めっき膜のエッジはより鋭利で、くさび形状に近づきます。 したがって、Ni80Fe20層の堆積にはスパッタリングの代わりに電気めっきが使用されました（図1a）。 さらに、電気めっき中の Au 膜接合部の高電界のため、NiFe 膜は細孔内にスパッタリングされた金層を包み込み、双極子に望ましいエッジ形状を形成します。 捕捉されなかったEVは、真っ直ぐな細孔を通過してフロースルーに収集される可能性があります（図1b）。 私たちは、モデルとして高密度リポタンパク質 (HDL) を使用して MNM の効率と特異性を証明し、この方法を使用すると HDL の >80% が回収され、市販キットの回収率のほぼ 2 倍になることが観察されました。 また、MNMは高くて一貫した収量を持っているため、不均一な生理液中のEVおよびリポタンパク質によって運ばれるバイオマーカーを定量するために必要な統計を提供できることも実証しました（図1c）。

a 磁性ナノ多孔質膜 (MNM) の製造。 全体として、80 nm の Au がトラックエッチングされた PET フィルム上に堆積され、電気めっきに対して良好な接着性と導電性が得られました。 次に、電気めっきにより 200 nm NiFe 膜を膜上に堆積しました。 非特異的吸着と化学的不安定性を軽減するために、最終的には合計 10 nm の Au が堆積されました。 右側: メンブレン上のナノポアの端にある不均一なナノエッジ接合が強調表示されています。 b MNM ベースの免疫捕捉セットアップ。 まず、抗体と抗原をインキュベートして Ab-Ag 複合体を形成し、続いて抗ウサギ IgG 抗体と結合した磁性ナノビーズとインキュベートしました。 次に、希釈したサンプルをシリンジとポンプを使用して MNM デバイスのチャンバーに通しました。 MNM デバイスは、2 つの 3D プリント チップの間に MNM を挟んで組み立てられました。 装置は 2 つの磁石の間に組み立てられ、入口近くの磁石はリング状になっていました。 強調表示されているように、磁性ビーズはナノ細孔の端に捕捉されました。 c 3 つのアプリケーションの実験手順。 抗 ApoA1 抗体を使用して HDL を捕捉しました。 非対称ナノポア膜を使用して、少量の HDL が残っている EV を分離し、MNM を使用して残留 HDL を除去して EV 画分を精製しました。 EV 画分では、MNM を利用して、特定の表面タンパク質、つまり EGFR で特定の EV を捕捉しました。

超常磁性ナノビーズの磁気モーメントは外部磁場によって誘導されるため、ナノビーズにかかる力は次のように表されます。

ここで、χeff はビーズの実効磁化率、V はビーズの体積、μ と μ0 は真空および材料の誘電率、\(\vec{B}\) は磁場です。 磁力は、磁場の勾配の 2 乗、または磁場の 2 倍に磁場の勾配を乗算すると増加します。 したがって、高い磁場だけでなく、高い磁場勾配が、高いビーズ回収率を達成するための鍵となります。 このような高い勾配は、鋭いジオメトリ (くさびや円錐) を使用して導入できます。 この電磁場の幾何学的強化は、大規模アンテナ 28、29 からナノ構造 30、31 まで、さまざまな工学設計に適用されています。 以前、我々は、誘電泳動によってコロイドを捕捉し、分子を移動させるために、マイクロチャネル23およびナノ細孔24の端にある特異電場を使用した。 図2a、cに示すように、スパッタリングされた膜上のナノポアの端は滑らかです。 スパッタリングの異方性の性質により、NiFe 層は Au 層の上部のみを覆っていました。 めっき中の電界集中により、電気めっき膜にはより鋭いエッジが現れました（図2b、d）。 幾何学的差異は膜の上部からも観察できます（図2e、f）。 スパッタ膜（図2e）と比較して、電気メッキ膜（図2f）のより微細な結晶化が観察され、電気メッキ膜によりより鋭いコーナーとより高い磁場勾配が達成できることを示唆しています。 スパッタリングとは異なり、電気めっきは 80 nm の金膜の側でも行われるため、NiFe 膜も細孔内で成長し、くさび型異種接合を形成しました。 0.4 テスラの均一な外部磁化の下では、0.48 テスラおよび 2.2 × 104 T2/cm と比較して、0.62 テスラの最大磁場と 2.3 × 105 T2/cm での磁束密度二乗の最大勾配が水相に発生します（図 2h）。くさびリングのないスパッタリングされた NiFe 膜の場合は cm であり、式 (1) の力場が 10 倍増加することを表します。 (1)。

(a) スパッタリングされた磁性ナノ多孔質膜、および (b) 電気めっきされた磁性ナノ多孔質膜上のナノ細孔の概略図。ナノ細孔の端が強調表示されています (最後の金の薄い層は無視されています)。 c スパッタリングされた磁性ナノ多孔質膜上の単一ナノ細孔の断面 SEM 画像。 NiFe 層 (青) の滑らかなエッジに注目してください。 d 電気めっきされた磁性ナノ多孔質膜上の単一ナノ細孔の断面 SEM 画像。 NiFe 層 (青) の鋭いエッジに注目してください。 (e) スパッタリングされた膜と (f) 電気めっきされた膜の SEM 画像。 g 理想的なスパッタリングされた磁性ナノ多孔質膜（上）と理想的な電気めっきされた磁性ナノ多孔質膜（下）のナノ細孔内の磁束密度（T）のシミュレーション。電気めっきされた MNM 上のウェッジでの磁束密度の劇的な増幅を示しています（膜の厚さはそのままにします）。右: 200 nm、150 nm、100 nm)。 h 磁場のシミュレーション。理想的なスパッタリング磁性ナノ多孔質膜 (上) と理想的な電気めっき磁性ナノ多孔質膜 (下) の両方のウェッジにおける磁束密度ノルム二乗 (T2/cm) の勾配を示します (膜厚さ左から右へ: 200) nm、150 nm、100 nm）。

高磁場の増強は、NiFe 膜の上端の水相単極子から始まります。ここで、高透磁率の超常磁性 NiFe 相のくさび角は約 π/2 であり、外側端の NiFe 相内の双極子から生じます。ウェッジ接合のベース。NiFe 側のウェッジ角度は約 3π/2 です。 双極子場は、透磁率が 40 分の 1 である水相に入るとさらに増幅されます。 スパッタリングされた膜では、エッジが滑らかであるため、弱い上部モノポールのみが存在します (図 2g)。 電気めっきされた NiFe 膜の鋭いエッジにおける双極子磁場と単極子磁場の組み合わせが、ナノビーズ捕捉力の 10 倍の増加の原因となっており、超常磁性ナノビーズについても同様の捕捉収率の増加が観察されると予想されます。

各ナノポアの周囲にマルチエッジ超常磁性ウェッジを備えた MNM の捕捉効率をテストするために、補足注 3 で説明されている MNM 免疫捕捉アプリケーション用のハウジング装置を設計しました。実験中に直径 2 cm の円形膜がテストされました。 。 簡単に説明すると、Exosome Isolation Kit Pan (マウス、Miltenyi Biotec) の 10 倍希釈 30 nm ナノビーズ 1 mL を、電気めっきされた 450 nm (PET 細孔サイズ) のナノ多孔質膜に 1 mL/h で通過させました。 すべての実験において、ナノビーズの量は MNM の飽和レベルを下回っています。 図 3b は、膜上での磁気捕捉の前後のビーズ溶液を示しています。 茶色がかったビーズの色は、フロースルー溶液では完全に消え、高いビーズ捕捉効率を示しています。 図3aに示すように、表面近くの流線によって対流されたナノビーズは、NiFe膜の上端近くの単極子によって捕捉されます。 残りのビーズは細孔の中心に対流され、細孔内の高双極子磁力によって捕捉されます（図 3c）。 健康なマウス血漿を使用して、MNM の EV 捕捉能力を検証しました (詳細は補足注 4)。 SEM画像（図3d）は、ナノポアの近くで捕捉されたナノビーズとドッキングしたマウス血漿エキソソームを示しています。

単極場によってナノ細孔の端近くで捕捉された磁性ビーズの SEM 画像。 さまざまな金属層を堆積した後、細孔の直径は約 300 nm まで減少しました。 b 磁性ナノ多孔質膜を通過させる前（左）および磁化膜で濾過した後（右）のビーズの溶液。 黄色は濃縮されたビーズを示します。 c 拡大したSEM画像は、ウェッジ接合の双極子場によって単一のナノポア内に捕捉されたナノビーズを示しています。 d ナノポア付近で捕捉されたマウス血漿エクソソームの SEM 画像。 e さまざまな流量および細孔サイズでのスパッタ膜および電気めっき膜のビーズ捕捉効率。 電気めっき膜については、元の細孔サイズ 450 nm および 1 μm、流量 1、5、および 10 mL/h がテストされました。 スパッタリングされた膜については、元の細孔サイズ 450 nm および流量 1 mL/h がテストされました (n = 3 の独立した実験)。 エラーバーは、各条件の標準偏差 (SD) を示します。

電気めっき後、細孔サイズは 450 nm から約 350 nm に縮小しますが、これは一般的な小型 EV (sEV) サイズの 30 ～ 200 nm よりも大きいため、ナノビーズのない非ターゲット EV の通過が可能になります。 ビーズ捕捉効率の定量的研究は、捕捉前後のナノ粒子追跡分析（NTA）によって測定されたビーズ濃度を比較することによって行われました（図3eを参照）。 1 mL/h では、ビーズの >99% が捕捉されました。 ビーズ捕捉効率は、5 mL/h の流速でも低下しませんでした。 このスループットは、ほとんどの細胞外小胞免疫捕捉アプリケーションにとって十分に高いものです。 さらに、流量を 10 mL/h に増加しても、ビーズの損失は 13% のみでした。 孔径 1 μm のメンブレンの場合、ビーズ捕捉効率は 1 mL/h で依然として > 80% でした。 まったく対照的に、スパッタリングされた 450 nm 膜によって捕捉されたビーズはわずか 22% でした (図 3e)。 300 nm を超える大きなベシクルの場合、細孔サイズ 1 μm の電気めっき MNM を、より低い流量またはより高い外部磁場で使用できます。

EVの捕捉におけるMNMの有効性に基づいて、この方法がリポタンパク質、つまりHDLを捕捉する能力を調査しようとしました（図4a）。 HDL は血漿やその他の生体液に非常に豊富に含まれており、定量化に使用できる標準コレステロールアッセイに基づいて追跡するための優れたモデルを提供します。 アポリポタンパク質 AI (apoA-I) は、HDL 粒子表面の主要な構造機能タンパク質です。 ApoA-I は主に HDL と関連しており、総 HDL タンパク質含有量の質量ベースで約 70% を占めます。 HDL サンプルは密度勾配超遠心分離 (DGUC) によってヒト血漿から単離され、総タンパク質レベルは比色分析によって定量されました 32。 捕捉のために、2 μg の抗 ApoA-I (Abcam、ab52945、ApoA1 に対するウサギ モノクローナル) 抗体を 100 μL の 100 μg/mL HDL サンプルと混合し、30 分間インキュベートし、100 μL の抗ウサギ IgG ナノビーズで処理しました ( 30 nm、Milyteni Biotec) で 1 時間。 HDL が磁性ナノビーズによって免疫捕捉された後、溶液を 1 × PBS で 500 μL に希釈し、450 nm 電気めっき MNM メンブレンに通した後、1 mL の 1 × PBS でフラッシュしてすべてのビーズをメンブレン上にもたらしました。表面を除去し、チャンバー内の残留 HDL 溶液を除去します。 各サンプルのフロースルーを収集しました。 コレステロールはリポタンパク質にのみ存在し、EVには存在しないため、コレステロール濃度を測定して、元のサンプルとフロースルーの両方のコレステロールの総量を計算しました（図4b）。 コレステロール捕捉率は次のように計算できます。

a コレステロールを尺度として使用した HDL 捕捉率の免疫捕捉の概略図。 3 つのケースでは、抗 ApoA1 抗体を使用した HDL の特異的捕捉と、抗体を使用しない非特異的捕捉および LDL に特異的な抗 ApoB 抗体について、異なる組み合わせをテストしました。 b (a) の 3 つのケースの捕捉率 (各ケースで n = 3 測定)。 c Miltenyi MACSTM μColumn や Thermofisher DynabeadsT​​M などのさまざまな免疫捕捉キットを使用した HDL 捕捉率の比較。 挿入図は、さまざまなテクノロジーの基本的な動作原理を示しています。 インキュベーション時間は、Dynabeads™ では 1 時間および 16 時間に選択されました (各メソッドで n = 7 回の測定)。 d qRT-PCR実験からのmiR-21のCt値。 MiRNA サンプルは、同じ開始サンプル量で MNM と Dynabeads™ の両方で捕捉された HDL から抽出されました (各サンプルにつき n = 3 測定)。 MNM 実験のインキュベーション時間は 1 時間、Dynabeads™ のインキュベーション時間は 12 時間です。 免疫捕捉とqRT-PCRの概略図を挿入図に示しました。 HDL は MNM または Dynabeads によって捕捉され、その後溶解され、その後 miRNA 抽出および qRT-PCR が行われました。 エラーバーは、各プロットの標準偏差 (SD) を示します。

注目すべきことに、このアプローチを使用すると HDL の >80% が回収されました。 私たちのデバイスにおける免疫捕捉と非特異的吸着の特異性を確認するために、2 つのネガティブ コントロールをテストしました。 実験でナノビーズ上に抗体が官能化されなかった場合、デバイス内で HDL の 10% 未満が失われますが、これは非特異的吸着と実験誤差によるものです。 低密度リポタンパク質（LDL）の構造タンパク質であるアポリポタンパク質Bに対する抗体（Abcam、ab139401、ApoBに対するウサギモノクローナル）を抗ApoA-Iの代わりに使用すると、損失は14％に増加した。 さらに 4% の損失は、抗 ApoB による HDL の非特異的捕捉に起因する可能性があります。 どちらのネガティブコントロールでも、15% 未満の非特異的捕捉率は 80% の特異的捕捉率よりも大幅に低くなります。 標準プロトコールを使用して、市販の免疫捕捉キットに対するメソッドをベンチマークしました (補足注 5 を参照)。 図 4c に示すように、ナノビーズの場合、充填カラムのビーズ捕捉効率が低いため、μColumn (Milyteni Biotec) では 20% の HDL のみが捕捉されました。 さらに、Dynabeads™ のようなマイクロビーズの場合、標準プロトコルよりもはるかに長い 16 時間のインキュベーション後でも、HDL 捕捉効率は 50% を超えません。 ナノビーズと同じ 1 時間のインキュベーション時間では、HDL は 25% しか回収されず (補足図 S4)、非特異的捕捉率はわずかに 15% を超えました。

MNM 免疫捕捉法の利点をさらに実証するために、MNM と Dynabeads™ の両方で捕捉された HDL に対して miRNA 抽出と miR-21 の qRT-PCR 定量を実行しました。 図 4d は、2 つの免疫捕捉法間の Ct の差が 6 を超えていることを示しています。これは、Dynabeads™ の miRNA 発現結果が MNM (デルタデルタ Ct 法) の miRNA 発現結果より 64 倍低いことを示唆しています。 マイクロビーズに必要な長いインキュベーション時間は、サンプルの分解、miRNA の分解、および吸着を引き起こし、miRNA の定量化に重大な偏りをもたらします。 対照的に、高速 MNM 免疫捕捉では高濃度の miR-21 が保存されました。

このデモンストレーションでは、まず 100 μL の健康なヒト血漿を希釈し、30 nm の非対称ナノ多孔質膜 33 による接線流濾過によって処理して、HDL およびその他のリポタンパク質の大部分を除去しました（図 5a）。 図５ｂに示すように、濾過後、大部分がＬＤＬおよびＶＬＤＬからのコレステロールがまだ１７％残っていた。 元の血漿中の主な量の HDL により、濾過されたサンプル中に少量の HDL が存在する可能性もあります。 したがって、濾過したサンプルを2μgの抗ApoA-I抗体および2μgの抗ApoB抗体と混合し、30分間インキュベートしました。 これらのアポリポタンパク質はリポタンパク質に特異的ですが、EV には特異的ではありません。 ２００μＬの抗ウサギＩｇＧマイクロビーズ（３０ｎｍ、Ｍｉｌｙｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加し、１時間インキュベートした後、混合物をＭＮＭに通した。 収集されたフロースルーは精製された EV サンプルであり、図 5c の NTA 特性評価からの元の EV の 85% が含まれていましたが、元のコレステロールは 5% しか含まれていませんでした。 図5cに見られるように、EVサンプルのサイズ分布も精製後も保存されており、MNMがEVの数の85％を保持しているだけでなく、EVの溶解または合体も回避されていることを示しています。 図5cのCD63およびCD9のELISA結果でも、抗ApoA-Iおよび抗ApoBプルダウン手順によるMNM精製の前後での損失が最小限（13〜17％）であることが確認されました。

EVの分画とHDLの免疫捕捉の概略図。 希釈された血漿 (サンプル I) は、非対称ナノ多孔質膜を通過してサイズ排除メカニズムで他の粒子を除去し、EV 画分 (サンプル II) を取得します。 HDL の量が圧倒的に多いため、HDL のごく一部が EV 画分に残ったため、抗 ApoA1 抗体および抗 ApoB 抗体とともにインキュベートし、次に抗ウサギ IgG 抗体と結合した磁性ナノビーズを MNM デバイスに通しました。 HDL を除去するために、フロースルーを収集しました (サンプル III)。 b a)のサンプルI、II、IIIからの精製のさまざまな段階でのリポタンパク質（コレステロール）残存物、およびMNM免疫捕捉前後のEV濃度（サンプルIIおよびIII）（サンプルごとにn = 5測定）。 c MNM免疫捕捉前（サンプルII）および後（サンプルIII）のNTAを含むEVサンプルのサイズ分布は、最小のEV損失または溶解/合体を示しています。 （挿入図）ELISAによって測定されたMNM免疫捕捉前後のCD63およびCD9濃度（サンプルIIおよびIII）（CD63、CD9についてそれぞれn = 2および3の測定）。 エラーバーは、各プロットの標準偏差 (SD) を示します。

EV 分野における主な研究の方向性は、特定の（病気の）細胞から、または特定の経路によって分泌される EV を特定することです 14。 この研究では、まずサイズベースの ANM (非対称ナノ多孔質膜) 分離技術によってヒト結腸直腸癌細胞 (DiFi) から EV が単離されました。 次に、ANM EV 分離株からの EGFR 膜タンパク質を持つ特定の EV を MNM によってさらに単離し、EV の特定のサブクラスの正確な miRNA 定量を実証しました（図 6a）。 EGFR を含む DiFi EV の分析に基づくと、テトラスパニンの含有量に基づいて、単離された EV はエクソソームである可能性があります 34。 DiFi セルによって放出された EV の一部は、不活性型 EGFR と活性型 EGFR34 を示しました。 この実験では、活性型EGFRと不活性型EGFRの両方を捕捉するトータルEGFR抗体を利用しました。 DiFi 細胞培養上清は、まず 30 nm の非対称ナノ多孔質膜 33 を用いた接線流濾過によって処理され、浮遊タンパク質が除去されました。 簡単に説明すると、1 μg の抗 EGFR 抗体をサンプルに添加し、30 分間インキュベートしました。 100μLの抗ヒトIgGマイクロビーズ(30nm、Milyteni Biotec)を添加し、1時間インキュベートした後、混合物をMNMに通した。 シンテニン-1（EVタンパク質として15、35）およびEGFRのウェスタンブロットをANM単離画分とMNM捕捉画分の両方で実行し、EV含有量を検証します（図6e）。 プロセス中にすべての画分から miRNA を抽出し、qRT-PCR を実行して miR-21 レベルを評価しました。 図6bは、単離されたEGFR EV内のmiRNA含有量を示しています。フロースルー物質は、21％の誤差で元のサンプルの総miR-21レベルと等しく加算されますが、qRT-PCRが2倍の変化しか識別できないことを考慮すると、これは重要ではありません。 ANM 分離株中の EGFR の総量および MNM フロースルーも ELISA によって測定されます。 90%近くの低下が達成され、ほとんどのEGFRがMNM EGFR分離株に捕捉されたことが示されました(図6b、挿入図)。 MNM EGFR 分離株内の CD63 および CD9 濃度は、MNM 捕捉前の合計の半分に近く (図 6c)、これは miR-21 qRT-PCR 結果と一致しています (図 6b)。 私たちのシステムの定量化の可能性をさらに調査するために、ANM 処理した未希釈 DiFi サンプルと 8 倍希釈した DiFi サンプルの両方で同じ実験を行いました。 図6dに示すように、miR-21発現レベルの8.3倍の変化は希釈係数と一致しており、異なる初期サンプル濃度間で高い効率が一貫していることを示唆しており、これは定量的バイオマーカー研究にとって重要です。

EGFRによるEVの分別と免疫捕捉の概略図。 DiFi 細胞培養培地を非対称ナノ多孔質膜に通過させ、サイズ分離によって EV 画分を得て (サンプル I)、これを抗 EGFR 抗体とインキュベートし、次に抗ヒト IgG 抗体と結合した磁性ナノビーズとインキュベートしました。 次に、サンプルは MNM デバイスを通過し、磁性膜上に捕捉されたサンプルが溶解バッファーと混合され (サンプル II)、フロースルーが収集されました (サンプル III)。 b (a) のサンプル I、II、III のさまざまな DiFi エキソソーム画分の Hm-miR-21 発現レベル (各サンプルの n = 3 測定)。 (入口) I および III について EGFR の総量が測定され、ANM 分離 EV からの EGFR 陽性 EV のほとんどが MNM によって捕捉されることが示されました (各サンプルについて n = 7 測定)。 c ELISAによって測定されたANM分離株(サンプルI)およびMNM EGFR分離株(サンプルII)のCD63およびCD9濃度。 (各サンプルにつき n = 3 測定) d DiFi サンプルの 8 倍希釈前後の EGFR エキソソームにおける Hm-miR-21 の発現レベルおよびその qRT-PCR 結果の Ct 値 (各サンプルにつき n = 5 測定) ）。 e DiFi 細胞株から単離された EV のウェスタンブロット。 マーカーレーンの後、(1) ANM 分離 sEV。 (2) MNM ビーズで捕捉された sEV。 各ウェルには 40 μg のタンパク質をロードしました。 オデッセイの露出 (下: 10 分、上: 露出オーバー)。 上のパネルは EGFR で、下のパネルは syntenin-1 でそれぞれブロットされています。 エラーバーは、各プロットの標準偏差 (SD) を示します。

ここでは、ユニークな異種超常磁性接合を備えた電気めっき MNM の有用性と効率を実証しました。 この方法により、超常磁性ナノビーズを高効率に捕捉することが可能となる。 単一のデバイスで最大 5 mL/h で溶液からほぼ 100% のナノビーズ回収を達成しました。 捕捉されなかった EV はまっすぐな細孔を通過してフロースルーに収集されます。 HDL をモデルとして使用してデバイスの効率と特異性を証明し、HDL 粒子の 80% 以上が回収され、非特異的保持は 15% 未満と最小限に抑えられました。 私たちのシステムの高い一貫した収量は、EV、リポタンパク質、およびその他の細胞外 RNA キャリアの研究に定量化の可能性をもたらします。 さらに、エクソソームの捕捉、HDL が豊富な EV サンプルの精製、EGFR 陽性 EV の特性評価における MNM のパフォーマンスを実証しました。 この研究の直接溶解プロトコルは、qRT-PCR、MS ベースのプロテオミクス、シーケンスなど、バイオマーカーの発見と診断のためのさまざまな下流分析に適用できます。薬物送達、組織工学、および無傷の EV を必要とするその他のアプリケーションにも適用できます。通信事業者には、EV 解放プロトコルが必要です。 解離バッファー 36、37、光切断可能なリンカー 38、およびプロテアーゼ感受性リンカー 39 は、MNM から EV を分離するための潜在的な戦略です。 当社のプラットフォームは、捕捉効率とスループットが重要な他の分子またはウイルス免疫捕捉アプリケーションにも適用できます。 リキッドバイオプシー用途（疾患スクリーニングおよび治療管理）のための血漿からの特定のEVの単離に加えて、MNMテクノロジーは、ここでDiFiサンプルおよび臓器について実証したように、細胞培養からのバイオマーカーの発見にも役立つはずです。 -オンザチップまたはオルガノイドモデル35、40、41、42。

COMSOL を使用して、さまざまなナノ細孔構造をモデル化およびシミュレーションし、磁束密度とその勾配を推定しました。 2 次元 (2D) 軸対称ジオメトリ モデルが、AC/DC モジュールの磁界、無電流インターフェイスで使用されました。 ソフトウェア内蔵の NiFe BH 曲線を使用しました。 モデルの遠い境界には 0.5 T の静磁束密度が適用されました。 シミュレーションは、非常に細かい要素の物理制御されたメッシュを使用して実行されました。 詳細については、補足説明 1 を参照してください。

表面 SEM 画像は Magellan 400 で撮影しました。EV 捕捉膜の固定には 2% EMS 品質のパラホルムアルデヒド水溶液が使用され、導電性のために 2 nm の金が事前にスパッタリングされました。 小胞は低ビームエネルギー下で検査されました。 ナノ細孔の断面は、Helios G4 UX DualBeam (Thermo Scientific) を使用して調製されました。 Pt EBID で断面表面を保護した後、ガリウム イオンの集束 10 keV ビームで動作する Auto Slice & View™ 4 (AS&V4) ソフトウェアを使用して、厚さ 5 nm のスライスを連続的に取得しました。 細孔の中心でスライスを停止し、二次電子用のTLD検出器を使用して3 kVの電圧で画像を取得しました。

使用したトラックエッチングされた PET フィルム (PET115745、Wuwei Kejin Xinfa) は厚さ 11 μm、細孔密度 5 × 107/cm2 です。 電気メッキされた磁性ナノ多孔質膜を作製するために、FC-1800 エバポレーターでトラックエッチングされた PET フィルム上に 80 nm の Au が堆積されました。 金層はポリマーと NiFe の間に良好な接着性をもたらし、電気めっきのシード層として機能します。 膜を4cm×4cmの小片に切断した。 銅テープを使用して膜を支持体上に固定し、カソードに電気的に接続した。 ニッケル板をアノードとして使用した。 文献 43、44 から適応された電気めっき溶液は補足ノート 6 にあります。2 mA/cm2 の定電流密度は Keithley 2636A Dual-Channel System SourceMeter によって適用されました。 電気めっきプロセス中に電圧が監視されます。 カスタムの電気めっき撹拌タンクは、均一な析出を実現するために設計されました。 堆積速度は、同じ条件下で成長させた厚いサンプルの SEM 画像によって導出されました。 非特異的吸着と化学的不安定性を軽減するために、NiFe 層の上にさらに 10 nm Au が堆積されました。 膜の追加の特性評価については、補足ノート 2 で詳しく説明されています。

電気めっきサンプルと同様に、最初に 80 nm Au が PET フィルム上に堆積されました。 スパッタリングされたサンプルは、市販の UHV スパッタリング システム Oerlikon DCSS で、Ni80Fe20 ターゲットを使用して室温で調製されました。 堆積中、Ａｒガス流量は２０ｓｃｃｍに固定され、プラズマ電力は５０Ｗであった。 堆積速度は、触針式粗面計と、同じ条件下で成長させた厚いサンプルの SEM 画像を使用して得られました。 スパッタリング後、NiFe 層の上部に 10 nm の Au が堆積されました。

匿名化された血漿サンプルは Zen-Bio Inc. から入手し、EDTA 凝固剤を含むチューブに収集された 10 mL の新鮮なヒト血漿で構成されていました。 各サンプルは、FDA の要求に従って病原体について検査されました。 人間の参加者を含む研究で実施されたすべてのアッセイプロトコルは、ノートルダム大学の倫理基準に従っていました。

DiFi 細胞は、FiberCell Systems の定義された無血清培地 (CDM-HD) を使用し、メーカーの指示 (FiberCell Systems、メリーランド州ニューマーケット) を使用して、20 kDa 細孔の C2011 FiberCell バイオリアクター内で増殖させました。 具体的には、バイオリアクターを滅菌 1 × DPBS (Corning、ニューヨーク州コーニング) で一晩洗浄し、次に高グルコース DMEM (hgDMEM/Corning) で一晩洗浄しました。 バイオリアクターを、２０ｍｌのＤＭＥＭ中の０．５ｍｇのウシフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）で４時間から一晩処理した。 次に、バイオリアクターを 10% ウシ成長血清 (1% ペニシリン-ストレプトマイシン [Pen/Strep、GIBCO、ダブリン/アイルランド]、1% グルタミン [GIBCO]、1% グルタミン [GIBCO]、1% 非必須) を含む完全 hgDMEM で一晩洗浄しました。アミノ酸[GIBCO])。 バイオリアクターには、10% 血清を含む完全 hgDMEM 中の 1 ～ 5 × 108 DiFi 細胞をロードし、1 時間放置した後、10% 血清を含む完全 DMEM を循環させました。 グルコースレベルをグルコメーター（CESCO bioengineering、ペンシルバニア州トレボース）で毎日監視し、グルコースレベルが開始培地中のグルコースレベルの半分になったら、培地ボトルを交換した。 その後の培地交換では、バイオリアクターの濃度を 10% ウシ血清から 5%、さらに 3% に変更し、その後 10% CDM-HD (DMEM-HD) 培地に切り替えました。 細胞がDMEM-HD内で確立されると(DMEM-HD内で少なくとも2週間)、馴化培地の日常的な採取を実行し、1日当たり20mlの馴化培地を除去した。 収集した培地を 2000 rpm で回転させて細胞と大きな破片を除去し、その後培地のサブフラクションをさらに Millex 0.22 μm 孔シリンジフィルター (Millipore Sigma、マサチューセッツ州バーリントン) を通して重力濾過しました。 少なくとも 3 日間の濾過培地コレクションをプールしました。

血漿は、積極的なヴァンダービルト IRB プロトコルおよびガイダンスの下で、同意したヒト参加者から収集されました。 血液をEDTAを含む採取管に採取し、直ちに遠心分離して血漿を分離した。 HDL および LDL は、以前に記載されているように、KBr 密度勾配超遠心分離 (DGUC) によってヒト血漿から単離されました 32。 簡単に説明すると、ネイティブ LDL (1.019 ～ 1.062 g/L) および HDL (1.063 ～ 1.021 g/L) を、SW41Ti または SW32Ti ローターを備えた Optima XPN-80 超遠心分離機 (Beckman-Coulter) を使用した連続 DGUC によって単離しました。 ＨＤＬおよびＬＤＬを、緩衝液を４回以上交換してＰＢＳ中で透析し、分子量３０００Ｄａのカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。 総タンパク質レベルは、BCA 比色アッセイ (Pierce、ThermoFisher) によって各リポタンパク質サンプル (HDL および LDL) について測定されました。

磁性ナノビーズはMiltenyiから購入し、そのまま使用します。 これらのナノビーズは 20 ～ 30 nm (SEM で確認) で、抗体で機能化されています。 エクソソーム分離キット Pan、マウス (カタログ番号 130-117-039)、抗ウサギ IgG マイクロビーズ (カタログ番号 130-048-602)、および抗 IgG マイクロビーズ、ヒト (カタログ番号 130-047-501) をそれぞれ使用します実験ごとに。

コレステロール定量アッセイキット (Sigma-Aldrich、CS0005) を使用して、サンプルのコレステロール濃度を測定しました。 簡単に説明すると、44μLのアッセイバッファー、2μLのプローブ、2μLの酵素ミックス、2μLのコレステロールエステラーゼ、および50μLのサンプルを混合し、各ウェルで37℃で30分間インキュベートしました。 検量線は、コレステロール 0 ～ 5 μg の標準サンプルを使用したすべての測定に対して確立されました。 すべてのサンプルはアッセイバッファーで検量線の範囲まで希釈されました。 570 nm での吸光度を測定し、同じプレート上の標準と比較して総コレステロールを測定しました。

メーカーのマニュアルに従って、NucleoSpin® miRNA Plasma Kit (Takara Bio) を使用してサンプルから miRNA を単離しました。 まず、300μLのサンプルを90μLのMLP溶液と混合し、室温で3分間インキュベートし、続いて30μLのMPP緩衝液を添加し、室温で1分間インキュベートした。 RNase フリー水中の 3.5 μL (1.6 × 108 コピー/μL) の cel-miR-39-3p を、正規化スパイクイン コントロールとしてライセートに添加しました。 次いで、混合物を11,000×gで遠心分離した。 上清を採取し、400μLのイソプロパノールと混合した。 混合物を結合カラムに移し、11,000 × g で 30 秒間遠心分離しました。 次に、カラムを 100 μL MW1 および 700 μL MW2 で 11,000 × g で 30 秒間連続して洗浄し、続いて 250 μL MW2 で洗浄し、11,000 × g で 3 分間乾燥しました。 最後に、室温で 1 分間インキュベートした後、30 μL RNase フリー水を加えて 11,000 × g で 1 分間 miRNA を溶出しました。 逆転写は、miScript II RT Kit (Qiagen) を使用して実行されました。 20 μL の逆転写反応は、2.2 μL の溶出 miRNA、4 μL 5 × miScript HiSpec Buffer (Qiagen)、2 μL 10 × miScript Nucleics Mix (Qiagen)、9.8 μL RNase-free 水、および 2 μL miScript Reverse Transcriptase を用いて調製しました。ミックス（キアゲン）。 反応物を 16 °C で 60 分間インキュベートし、続いて 95 °C で 5 分間インキュベートしました。 次いで、逆転写反応物を200μLのRNaseフリー水で希釈した。 miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) を使用して qPCR 反応を 3 回実行し、StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) で実行しました。 反応液には、2 μL の希釈 cDNA、12.5 μL の 2・QuantiTect® SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)、2.5 μL の 10・ miScript Universal Primer (Qiagen)、標的 miRNA 用の 10・ miScript Primer Assay (Qiagen)、および 5.5 μL が含まれていました。最終容量 25 μL の RNase フリー水。 反応混合物を95℃で15分間インキュベートした後、94℃で15秒間、55℃で30秒間、および70℃で30秒間を45サイクル行った。 Ct 値は、MIQE ガイドライン 45 に従って StepOne™ ソフトウェア v2.3 を使用して取得および分析されました。 標的 miRNA の Ct 値は、miRNA 抽出中に追加されたスパイクイン標準コントロール (cel-miR-39-3p) によって調整されました。 発現量はデルタデルタ Ct 法により計算されます。

ヒト EGFR ELISA キット (EGFR0、R&D Systems™)、ヒト CD63 ELISA キット (カタログ番号 EH95RB、Invitrogen)、およびヒト CD9 ELISA キット (#MBS7607059、MyBioSource) を、メーカーの指示に従ってそれぞれサンプル中の特定のタンパク質を定量するために使用しました。 。 MISEV2018 ガイドライン 46 から選択された EV マーカー CD9 および CD63 が、EV サンプルからさまざまな濃度で検出されました。 標準曲線が各プレートに対して確立され、タンパク質の濃度が読み取り値によって決定されました。

ウェスタンブロットは、以前に記載された一般的なプロトコールに従って行われました47。 簡単に説明すると、タンパク質は、製造業者の指示に従ってBCA (Thermo、カタログ番号 23235) によって定量されました。 40 マイクログラムのタンパク質を 11% SDS-ポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードし、160 V で約 5 時間電気泳動しました。 分離されたタンパク質を 4 °C、25 ボルトで一晩ニトロセルロース膜に転写し、Intercept ブロッキングバッファー (Li-COR、カタログ番号 927-60001) で 4 ～ 5 時間ブロックしました。 サイズ標準（Bio-Rad、カタログ番号 1610374）で区切られた見かけの分子量に基づいて、ニトロセルロース膜をブロッティング用の分子量領域に切断しました。 EGFR (Millipore Rb、1:1000、カタログ番号 06-847) およびシンテニン (Abcam、Rb、1:5000、カタログ番号 Ab133267) 抗体を免疫ブロットに使用しました。 ニトロセルロースをこれらのマーカーの上部、中央、下部にそれぞれ切断しました。 次いで、ブロットを二次ヤギ抗ウサギ IRDye 800 CW (LI-COR、1:5000、カタログ番号 926-32213) でプローブしました。 膜は Odyssey によって開発されました (Li-COR)。

ナノ粒子追跡分析 (NTA) は、MISEV2018 ガイドライン 46 に従って、NanoSight NS300 (NanoSight Ltd.、エイムズベリー、英国) を使用して実行されました。 すべてのサンプルは、1 × PBS を使用して測定前に最適な作業粒子範囲に希釈されました。 カメラレベルを 10 に設定して各サンプルの 5 つの 60 秒ビデオを記録しました。記録中は 1000 の一定流量設定を維持しました。 測定中は温度を監視しました。 測定の間に装置を 1 × PBS でフラッシュしました。 各サンプルについて記録されたビデオを NTA ソフトウェアで分析し、測定された粒子の濃度とサイズ分布を対応する標準誤差とともに決定しました。 同じ検出閾値を分析に使用しました。

生物学的複製の数と行われた測定値は、各図で明らかにされています。 すべてのデータセットの標準誤差は、OriginPro ソフトウェアを使用して計算およびプロットされ、手動で二重チェックされます。 データは個々のデータ点および平均±SEとして示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

グラフやチャートのソース データは、この記事に関連する補足データにあります。 この研究に貢献した追加データは補足情報に記載されています。 トリミングされていない未編集のゲル画像は補足図S7に含まれています。 この論文に関連するその他すべてのデータは、対応する著者に要求される場合があります。

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著者らは、戦略調整局/NIH局長室、1UH3CA241684-01を通じたNIH共通基金の支援に感謝します。 CZ は、中国奨学会奨学金の支援を認めます。 RJC は、NCI R35 CA197570 のサポートを認めます。 著者らは、Walther Cancer Foundation による Cancer Cure Venture (CCV) Grant の支援に感謝します。

Chenguang Zhang 氏、Xiaoye Huo 氏も同様に貢献しました。

ノートルダム大学化学・生体分子工学部、ノートルダム、インディアナ州、46556、米国

Chenguang Zhang、Xiaoye Huo、Satyajyoti Senapati、Hsueh-Chia Chang

ノートルダム大学生物学部、ノートルダム、インディアナ州、46556、米国

イニ・ジュー＆シン・ルー

ヴァンダービルト大学医療センター医学部、ナッシュビル、テネシー州、37232、米国

ジェームス・N・ヒギンボサム、鄭操、ジェフリー・L・フランクリン、ケイシー・C・ヴィッカーズ、ロバート・J・コフィー

細胞および発生生物学部、ヴァンダービルト大学医学部、ナッシュビル、テネシー州、37232、米国

ジェフリー・L・フランクリン & ロバート・J・コフィー

Aopia Biosciences、31351 Medallion Dr、ヘイワード、カリフォルニア州、94544、米国

ワン・セミン

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CZ、XH、CW、および HCC がこのアイデアを考案し、研究を設計しました。 CZ は有限要素シミュレーションを実行しました。 CZ、XH、CW、ZC が実験を実行しました。 CZ は結果を分析し、すべての著者からの意見を取り入れて原稿を書きました。 YZ、LX、JNH、JLF、KCV、および RJC は生体サンプルを提供しました。 CW、SS、HCC がプロジェクトを監督しました。

Ceming Wang または Hsueh-Chia Chang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Shi Hu、Yuanjin Zhao、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Huan Bao と Gene Chong。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Zhang、C.、Huo、X.、Zhu、Y. 他。 細胞外小胞およびリポタンパク質の高収量および高スループットの免疫捕捉のための電着磁性ナノ多孔質膜。 Commun Biol 5、1358 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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受信日: 2022 年 5 月 12 日

受理日: 2022 年 11 月 30 日

公開日: 2022 年 12 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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